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新手做WB，有一些问题求助啊！！！ 已有1人参与
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我是新手做WB的，有一些问题想请教大家，希望在这里能够到你们的解答。 我的目的蛋白的分子量是：57.5 kDa 、 135 kDa、 140 kDa、 285kDa、 1.我自己觉得一个胶应该做不了吧？可能需要跑两块。 那我想请问一下我应该如何安排比较合适呢（哪块胶跑多大的蛋白）？ 应该选多大分离胶浓度啊？ 2.电泳时的条件可以如何设置呢？（电压 时间，只求一个大概，根据你们做过类似大小的蛋白的经验） 3.我的内参可以选β-actin吗？ 因为我这方面没做过，是第一次接触，有很多不懂得问题，所以希望能够得到各位大神的指教。  |
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5楼2017-05-31 21:40:55
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1. 一个胶肯定是做不了的，135KD和140KD的两个蛋白很难跑开，建议用高浓度的胶比如15%的胶，将135和140分开于两块胶，另外因为你的最大的蛋白为285KD，有些marker的指示蛋白没那么大，所以在切胶和孵膜的时候要特别注意。 2. 电泳条件可以先70V后100V恒压（我们实验使用的是这个条件），因为电泳时你可以看到loading和marker的位置，所以你可以根据loading和marker的位置选择何时停止电泳。你的蛋白都很大，可以将电泳时间延长，在条件允许的情况下允许loading跑出胶外（loading的位置低于你的最小蛋白的位置）。 3. 内参一般选择β-actin或者GAPDH。 |
2楼2017-05-30 15:11:52
小角色大用途
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3楼2017-05-30 16:22:55
4楼2017-05-31 21:38:11