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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 双酶切连接不成功
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沉默、颜泪

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 我好暴躁啊 at 2017-05-21 10:21:34
层主，我现在也在做这个双酶切，有木有好办法确定双切成功，我现在是载体两个酶分开切，而且都是同时用两个酶单酶切，结果是，这俩酶都好使，但是目的基因就没法看是不是酶切成功了，转化后菌长了特别多。怎么改进 ...

做TA克隆，提取重组T质粒后进行双酶切。

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11楼2017-05-21 11:44:54
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胡奎0925

木虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 我好暴躁啊 at 2017-05-21 10:21:34
层主，我现在也在做这个双酶切，有木有好办法确定双切成功，我现在是载体两个酶分开切，而且都是同时用两个酶单酶切，结果是，这俩酶都好使，但是目的基因就没法看是不是酶切成功了，转化后菌长了特别多。怎么改进 ...

我是没有解决，我是为了构建载体，我改用同源重组的方法了
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宁愿被误会，坚决不解释
12楼2017-05-22 17:00:28
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我好暴躁啊

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 胡奎0925 at 2017-05-22 17:00:28
我是没有解决，我是为了构建载体，我改用同源重组的方法了...

我的载体三千多，目的片段三四千，连了好久，同源也做，各种连，还是没连上

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13楼2017-05-22 22:43:58
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丽姐萍妹

新虫 (正式写手)
试试看过夜酶切 快切酶不一定就2小时的 还有就是双切酶的体系 自己再好好斟酌下

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14楼2017-05-22 23:04:02
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Eccentric-

金虫 (小有名气)
试试同源重组方法啊

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15楼2017-05-22 23:10:57
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wy604987664

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 胡奎0925 at 2017-05-19 08:58:42
我前段也做双酶切，单切都能成功，但双切就是做不出来，我觉得你要确定双切是成功的

我也是，单切都没问题，打算一个一个切

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16楼2017-05-25 12:17:15
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wy604987664

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 沉默、颜泪 at 2017-05-21 11:44:54
做TA克隆，提取重组T质粒后进行双酶切。
...

我也是，怎么都不行，我做TA克隆了，还是不行

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17楼2017-05-25 12:19:07
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wy604987664

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 我好暴躁啊 at 2017-05-21 10:21:34
层主，我现在也在做这个双酶切，有木有好办法确定双切成功，我现在是载体两个酶分开切，而且都是同时用两个酶单酶切，结果是，这俩酶都好使，但是目的基因就没法看是不是酶切成功了，转化后菌长了特别多。怎么改进 ...

上面的建议我都快试过来了，但就是测序不对，最后一次，再不行，打算换个人做了

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18楼2017-05-25 12:21:55
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柑橘炒鸡蛋

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 我好暴躁啊 at 2017-05-21 10:21:34
层主，我现在也在做这个双酶切，有木有好办法确定双切成功，我现在是载体两个酶分开切，而且都是同时用两个酶单酶切，结果是，这俩酶都好使，但是目的基因就没法看是不是酶切成功了，转化后菌长了特别多。怎么改进 ...

亲 你解决了吗？我现在也在做双酶切，转化涂板长的菌特别少，并且还都是假阳性，怀疑是酶切不开的问题，我用的nde1和xho1两个酶37度过夜切，有没有什么好的方法能双酶切都切开啊！！！
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19楼2017-08-03 10:29:19
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