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wy604987664

新虫 (小有名气)

[求助] 双酶切连接不成功已有3人参与

用赛默飞快切酶Nde1和Sma1双酶切,Nde1和Bamh1双酶切,37℃酶切2小时,连接始终不成功,测序不是没信号就是载体自连。载体确定没问题,酶也没问题。做了3次了,什么问题呢?就差这两个载体实验就做完了,求帮助!!

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柑橘炒鸡蛋

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 我好暴躁啊 at 2017-05-21 10:21:34
层主,我现在也在做这个双酶切,有木有好办法确定双切成功,我现在是载体两个酶分开切,而且都是同时用两个酶单酶切,结果是,这俩酶都好使,但是目的基因就没法看是不是酶切成功了,转化后菌长了特别多。怎么改进 ...

亲 你解决了吗?我现在也在做双酶切,转化涂板长的菌特别少,并且还都是假阳性,怀疑是酶切不开的问题,我用的nde1和xho1两个酶37度过夜切,有没有什么好的方法能双酶切都切开啊!!!
19楼2017-08-03 10:29:19
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fjtony163

版主 (文坛精英)

米米

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-19 07:42:31
载体自连的话试试用用去磷酸酶处理一下vector
2楼2017-05-19 03:36:02
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stabilized

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
确认不是酶切不成功?双酶切无法使两种酶活力同时最大,所以可能有切不成功的问题。
坚持!
3楼2017-05-19 08:56:11
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胡奎0925

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我前段也做双酶切,单切都能成功,但双切就是做不出来,我觉得你要确定双切是成功的
宁愿被误会,坚决不解释
4楼2017-05-19 08:58:42
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