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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » Ni柱纯化蛋白双峰求助
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c269315986

新虫 (初入文坛)

[求助] Ni柱纯化蛋白双峰求助 已有3人参与

请问各位兄弟姐妹，Ni柱纯化蛋白梯度洗脱时出现双峰，分不开，请问是什么原因？以前纯化时是50%洗脱液有单峰，最近纯化就成双峰了，30%，50%。

@hc-material @gyesang 发自小木虫Android客户端
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1楼 2017-05-16 22:50:40
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

估计是聚体和单体，层析缓冲中加甘油，尿素等防止聚体的形成。
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11楼2017-08-08 10:53:52
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
跑电泳看一下这两个峰的样品是否都含有你的目的蛋白
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2楼2017-05-17 09:12:30
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walking dead

金虫 (小有名气)

填料制备和蛋白纯化专家

【答案】应助回帖

柱子使用次数多了，正常。一个是柱子及时再生，每次纯化完必须做，为了延长使用寿命和不干扰后面的使用。在一个就是可以用EDTA将Ni洗脱下来，再用氢氧化钠、氯化钠等好好清洗一下柱子，洗到中性后重新螯合金属离子。试试看，祝你顺利。
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9楼2017-08-03 16:34:57
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普通回帖

c269315986

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 十四_14 at 2017-05-17 09:12:30
跑电泳看一下这两个峰的样品是否都含有你的目的蛋白

实验室只有SDS电泳，跑过了，两个峰都只有目的蛋白，但不清楚是单体还是多聚体，打算用分子筛看看。还是没搞明白为什么会变成双峰。

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3楼2017-05-17 11:19:25
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以试试加大咪唑的浓度直接洗，跑电泳时一条带么
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4楼2017-05-17 11:51:40
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by c269315986 at 2017-05-17 11:19:25
实验室只有SDS电泳，跑过了，两个峰都只有目的蛋白，但不清楚是单体还是多聚体，打算用分子筛看看。还是没搞明白为什么会变成双峰。
...

恩可以考虑一下是不是蛋白结构发生变化

另外  你的柱子用了多久？有时候柱子用久了也会影响纯化结果的
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5楼2017-05-17 15:17:06
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c269315986

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hc-material at 2017-05-17 11:51:40
可以试试加大咪唑的浓度直接洗，跑电泳时一条带么

谢谢~可是蛋白是要结晶用的，不能单体和多聚体混合。。

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6楼2017-05-17 18:23:24
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c269315986

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 十四_14 at 2017-05-17 15:17:06
恩可以考虑一下是不是蛋白结构发生变化

另外  你的柱子用了多久？有时候柱子用久了也会影响纯化结果的...

谢谢~柱子刚换了新的。。。请问还有没有其他可能的原因导致蛋白结构变化了？

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7楼2017-05-17 18:24:36
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c269315986

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hc-material at 2017-05-17 11:51:40
可以试试加大咪唑的浓度直接洗，跑电泳时一条带么

谢谢~跑sds电泳是同一条带

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8楼2017-05-17 18:25:53
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c269315986

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by walking dead at 2017-08-03 16:34:57
柱子使用次数多了，正常。一个是柱子及时再生，每次纯化完必须做，为了延长使用寿命和不干扰后面的使用。在一个就是可以用EDTA将Ni洗脱下来，再用氢氧化钠、氯化钠等好好清洗一下柱子，洗到中性后重新螯合金属离子。 ...

非常感谢~

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10楼2017-08-03 18:14:24
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