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向日葵和梦缘

新虫 (初入文坛)

[求助] Red大肠杆菌基因敲除卡那霉素筛选问题 已有1人参与

开始做Red系统的E. coli基因敲除,电转后涂布卡那霉素平板(100ug/ml)没有菌落长出来。不知道是不是抗生素浓度太大的问题。
1、第一次电转PCR片段成功后,卡那霉素平板(50ug/ml)上长出了单菌落,随后又出现了很多小菌落,以为是抗生素浓度低未抑制。
2、随后又做了好几次感受态做电转,电转后涂布卡那霉素平板(100ug/ml)都没有菌落长出来。
  请教大神高手,不胜感激。
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向日葵和梦缘

新虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小冀- at 2017-05-07 09:37:07
我用的质粒是pkd46,诱导剂就是阿拉伯糖,终浓度30mM,接种时直接加进去,大概诱导两个多小时至OD到0.4...

接种时就加进去阿拉伯糖呀,我都是OD为0.1时加阿拉伯糖,在诱导至OD为0.3,应该是诱导的问题,谢谢啦

发自小木虫Android客户端
9楼2017-05-07 16:17:38
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junior850621

铁杆木虫 (著名写手)

还是五十吧,一百略高。或者试一下中间值?

发自小木虫Android客户端
2楼2017-05-05 20:34:09
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向日葵和梦缘

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by junior850621 at 2017-05-05 20:34:09
还是五十吧,一百略高。或者试一下中间值?

你做过这方面的敲除吗,感受态制作你加诱导剂诱导多长时间

发自小木虫Android客户端
3楼2017-05-06 08:06:19
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我们做的时候卡纳霉素浓度是30,筛选没有问题,估计是你转化的问题,目的片段没有导进去或者导进去之后没有发生同源重组,也可能是感受态做的问题,red系统表达量不够

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

···
4楼2017-05-06 11:53:12
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