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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » Gateway的LR反应后扩增不出条带
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德卡

新虫 (初入文坛)

[求助] Gateway的LR反应后扩增不出条带 已有2人参与

我做的是将E8启动子和目的基因片段通过LR反应连接到表达载体上，但是LR反应后，用E8启动子的引物扩增不出来条带。用的是菌落PCR，吸两百微菌液离心，去离子水重悬，体系是20微升，mastermix10微升，水6微升，引物2微，模版2微。条件是94°C5min，94°C30s，48-55°C梯度30s，72°C2min45s，片段大小为2400bp，30个循环，老是扩增不出条带。但是用目的基因的引物可以阔出小的片段。求问该怎么办啊

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1楼 2017-04-26 23:40:53
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德卡

新虫 (初入文坛)
老大哥们，有没有人啊

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2楼2017-04-28 00:02:15
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
建议重做LR反应看看呢

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竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
3楼2017-04-28 00:47:10
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-04-30 09:50:12
这个可以用infusion重组

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4楼2017-04-28 00:48:06
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德卡

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by MAS_rice at 2017-04-28 00:47:10
建议重做LR反应看看呢

我重做了好几次，就是做不出来，做infusion的话是不是要从头设计引物啊

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5楼2017-04-30 09:04:13
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-01 22:34:17
引用回帖:
5楼: Originally posted by 德卡 at 2017-04-30 09:04:13
我重做了好几次，就是做不出来，做infusion的话是不是要从头设计引物啊
...

也有可能是你们的LR酶坏掉了，我之前也没做出来，后来买了新的酶就做出来了。infusion 要重新设引物，有在线设引物的网站，LR酶还挺贵的，你可以尝试infusion

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6楼2017-04-30 10:08:49
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德卡

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by MAS_rice at 2017-04-30 10:08:49
也有可能是你们的LR酶坏掉了，我之前也没做出来，后来买了新的酶就做出来了。infusion 要重新设引物，有在线设引物的网站，LR酶还挺贵的，你可以尝试infusion
...

好吧，我是用中间的引物能够扩出来小片段，但是用启动子的引物不能扩增出来。老师说可能是启动子丢了

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7楼2017-05-01 21:44:03
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chenmx1257

新虫 (初入文坛)
换一家国产的premix试试。我们也是总p不出来。换了就随便做随便成功。

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8楼2017-05-24 09:23:07
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德卡

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by chenmx1257 at 2017-05-24 09:23:07
换一家国产的premix试试。我们也是总p不出来。换了就随便做随便成功。

谢啦，我扩出来了，真的是含启动子，不好扩

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9楼2017-05-24 09:52:49
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onemoretimer

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 德卡 at 2017-05-24 09:52:49
谢啦，我扩出来了，真的是含启动子，不好扩
...

是换了其他的酶之后成功了吗，方便告知是什么酶吗

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one by one
10楼2018-07-09 00:15:21
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