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RNA 实验中DNA酶处理后遇到问题，求助高手帮助！
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第一步 Trizol 方法提取链霉菌发酵液中菌丝体的RNA， 取3ml发酵液碾磨, 最后提取完溶解到50ul水中，离心取上清部分到另一干净的新管中，取1ul样品上普通琼脂糖电泳（同DNA电泳，换新buffer，180v25min）检测结果如下：左边是DNA Marker III，后面四个为样品 从琼脂糖检测结果来看，似乎没有问题 第二步 DNA酶处理后反转录PCR 采用TaKaRa的产品D2215 ：DNaseI（RNase Free），按照说明书操作 取30ul第一步的总RNA样品 1*buffer 2ul（5u/ul）DNaseI 0.5ul RNase Inhibitor（40u/ul） DEPC水到50ul 37度30分钟后酚：氯仿：异戊醇，氯仿：异戊醇各抽提一遍后，乙醇（NaAC）沉淀，70%乙醇洗涤后自然干燥后溶于10ul水中，取1ul电泳检测，电泳条件同前，只检测到200bp位置有smear，以为是量少检测不到，取5ul进行反转录，后用特定引物扩增，目标条带应该为450bp左右，电泳检测结果显示只有作为对照的16s能够扩增出300bp条带，而我要的条带没有扩增出来，将内存引物和我的目的引物放到一起或单独都不能扩增出我的目的条带，而都能够扩增对照的16s条带 结论：DNA酶处理后两次抽提使得RNA降解？虽然我在做这步操作时比第一步要做的小心的多，但还是出现了问题，怎么会这样呢？？ 换用不需要后处理的酶进行处理，采用Promega的DNaseI，按照说明书操作 取10ul第一步的总RNA样品 1*buffer 2ul（5u/ul）DNaseI 0.5ul RNase Inhibitor（40u/ul） DEPC水到20ul 37度15分钟后加入失活剂后70度10分钟 取1ul样品进行反转录，同样没有扩增到目的条带而对照能够扩得很好 以为可能是由于两步反应要求的离子浓度不一样，所以才造成反转录效果差，采用反转录的buffer进行DNaseI处理后加热失活后取2ul反转录，仍然没有扩增出我需要的结果，为什么会这样呢？ 以为是放在-80度的总RNA样品存在降解，拿出来又跑了一次，还是如同刚提出来的时候一样没有看到降解，为什么会这样，请有经验的高手给予指点和帮助，非常感谢！ 实验失败现极度崩溃中，请求高手帮助啊！ [ Last edited by 350784478 on 2009-10-22 at 15:52 ] |
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sutao1979
木虫 (著名写手)
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2楼2009-01-04 17:40:42
3楼2009-01-05 11:13:30
4楼2009-01-05 11:51:07
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xiaomuchongfei 你好! 如果DnaseI处理之后不进行纯化的话，反转录酶需要的buffer离子浓度和Dnase I的buffer离子浓度要求不一样，Dnase I的Mg+浓度要高很多，如果将DnaseI处理之后的样品稀释10倍加入到反转录体系中的话，会不会也会浓度很低，这个问题怎么解决？我上次用promega 的DNase处理（8ulRNA样品/15ul体系）后加入变性剂再加热失活后取1ul到10ul反转录体系中进行反转录，反转录后取1ul，2ul，3ul都没扩出来我的条带，现在我也不知道到底是怎么搞得老是失败了 xiaomuchongfei 如果方便的话，可不可以将你的处理方法给我一份，包括酶的厂家和用量？非常感谢你的帮助和指导！ |
5楼2009-01-06 09:30:01
6楼2009-01-06 09:56:47