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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » T4连接的问题
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c8899747

新虫 (初入文坛)

[求助] T4连接的问题 已有1人参与

有A、B两个目的片段，A大小400bp，B大小1700bp，两个目的片段同时扩大，回收，T4处理，并同时连接3个不同载体，连接时间22度4h或16度过夜。挑斑检测，A阳性率90%,B阳性率0%，排除目的片段有问题的可能，请问哪里出了问题？

@wizardfan @biostar2009 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2017-04-11 23:41:47
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
增加B的使用量，提高5 - 10倍。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

c8899747 c8899747
2楼2017-04-13 12:00:45
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c8899747

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2017-04-13 12:00:45
增加B的使用量，提高5 - 10倍。

谢谢你的解答，按照你所说的，如果我的B的量加少了，挑斑用两头通用引物检测会出现空载吗？因为我检测B的时候发现全部都是空载的片段大小，也就是B没有连上，然后载体发生自连了，可以这样解释吗，载体是用CpoI和NotI酶切的

发自小木虫IOS客户端
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3楼2017-04-14 15:39:38
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c8899747

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2017-04-13 12:00:45
增加B的使用量，提高5 - 10倍。

或者说可以挑出来，但是阳性率非常低

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4楼2017-04-14 15:40:37
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
3楼: Originally posted by c8899747 at 2017-04-14 15:39:38
谢谢你的解答，按照你所说的，如果我的B的量加少了，挑斑用两头通用引物检测会出现空载吗？因为我检测B的时候发现全部都是空载的片段大小，也就是B没有连上，然后载体发生自连了，可以这样解释吗，载体是用CpoI和N ...

无论用什么酶双酶切都可能在细菌中自连接。
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5楼2017-04-14 16:44:25
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