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maobohe金虫 (小有名气)
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细菌DNA提取的问题
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我们实验室培养的一种细菌能分泌大量的胞外多糖，在提取DNA时，前面各操作步骤现象都比较正常，可最后用两倍体积的冷冻过后的无水乙醇沉淀，根本沉不出来；改用一倍体积异丙醇，能沉出很大一团（加DDWater静置，不易溶解），可跑胶后发现没有大分子DNA。不知是什么原因，请各位赐教啊，谢谢啦！ 我的实验步骤： 1 离心发酵液，收集菌体 2 加溶菌酶液体50微升，37摄氏度金属浴1小时 3 加裂解缓冲液200微升，待液体发黏透明后加5M的氯化钠溶液66微升，离心，取上清 4 加等体积tris饱和酚，混匀，离心，取上清 5 加等体积氯仿，混匀，离心，取上清 6 两倍体积冷冻无水乙醇（或等体积异丙醇）沉淀， 7 70％乙醇洗两遍后，50微升DDWater溶 |
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lauren180
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maobohe(金币+2,VIP+0):shiyishi
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1. 抽提缓冲液 2% CTAB (W/V) 2% PVP K25 (w/v) （去色素） 100mM Tris-HCl (pH8.0) 25mM EDTA (pH8.0) 2.0M NaCl 2.10M LiCl 3. 2M LiCl 4.DEPC-water（抑制RNA酶活性） 5. 3M NaAc (pH5.2) 6. 96% 乙醇 7. 70% 乙醇 步骤： 1.抽提缓冲液65℃预热； 2. 加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min； 3. 加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，离心12,000rpm，10min； 4.取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，离心12,000rpm，10min； 5. 取上清，重复4步骤； 6. 加10M LiCl 1/4体积到上清液； 7.4℃过夜，沉淀DNA； 8. 离心（12,000rpm，10min），弃上清； 9. 70％乙醇洗，再用100％乙醇洗，风干； 10. 加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－200C沉淀； 11. 离心12,000rpm，10min； 12. 弃上清，70％乙醇洗，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。 |
2楼2009-01-01 21:33:12
分子克隆那本书上的技术很成熟的
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3楼2009-01-01 22:14:18
cherry3862
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4楼2009-01-02 10:15:42
