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maobohe

金虫 (小有名气)

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[交流] 细菌DNA提取的问题

我们实验室培养的一种细菌能分泌大量的胞外多糖，在提取DNA时，前面各操作步骤现象都比较正常，可最后用两倍体积的冷冻过后的无水乙醇沉淀，根本沉不出来；改用一倍体积异丙醇，能沉出很大一团（加DDWater静置，不易溶解），可跑胶后发现没有大分子DNA。不知是什么原因，请各位赐教啊，谢谢啦！
我的实验步骤：
1 离心发酵液，收集菌体
2 加溶菌酶液体50微升，37摄氏度金属浴1小时
3 加裂解缓冲液200微升，待液体发黏透明后加5M的氯化钠溶液66微升，离心，取上清
4 加等体积tris饱和酚，混匀，离心，取上清
5 加等体积氯仿，混匀，离心，取上清
6 两倍体积冷冻无水乙醇（或等体积异丙醇）沉淀，
7 70％乙醇洗两遍后，50微升DDWater溶

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1楼 2009-01-01 20:33:05

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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人

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专业: 环境微生物学

★ ★
maobohe(金币+2,VIP+0):shiyishi

1. 抽提缓冲液
2% CTAB (W/V)
2% PVP K25 (w/v) （去色素）
100mM Tris-HCl (pH8.0)
25mM EDTA (pH8.0)
2.0M NaCl
2.10M LiCl
3. 2M LiCl
4.DEPC-water（抑制RNA酶活性）
5. 3M NaAc (pH5.2)
6. 96% 乙醇
7. 70% 乙醇
步骤：
1.抽提缓冲液65℃预热；
2. 加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min；
3. 加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，离心12,000rpm，10min；
4.取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，离心12,000rpm，10min；
5. 取上清，重复4步骤；
6. 加10M LiCl 1/4体积到上清液；
7.4℃过夜，沉淀DNA；
8. 离心（12,000rpm，10min），弃上清；
9. 70％乙醇洗，再用100％乙醇洗，风干；
10. 加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－200C沉淀；
11. 离心12,000rpm，10min；
12. 弃上清，70％乙醇洗，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml 水中。