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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于基因片段插入位点的问题！
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安静的位置i

金虫 (小有名气)

[交流] 关于基因片段插入位点的问题！

我用的质粒上能够使用的酶切位点非常有限，目前想插入一个片段，只有两个酶切位点可用于双酶切后再连接（没有其他选择），但是其中一个位点在我的目的片段上也存在！怎么能解决这个问题啊？请高人指点！
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1楼 2009-01-01 11:30:17
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
sxdxrhyy(金币+2,VIP+0):谢谢参与！
提供一个思路，你用这两个酶来切，在你的基因片段前加上这两个酶切位点，做一个酶的梯度实验，酶切的时候，有可能出现三种情况，一是两个都切开，其次是分别切开其中的一个位点，这时根据你的基因大小判断你酶切目的条带的大小，你酶切回收你的产物
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帮助虫友，提升自己
2楼2009-01-01 13:53:56
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
sxdxrhyy(金币+2,VIP+0):谢谢参与！
那还不如单酶切来得实际
切完测个序确定方向就好了，简单
50%的机会嘛~~
第一天酶切，连接，转化
第二天挑单克隆摇菌，叫人拿测序
然后再等3天
结果就出来了
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3楼2009-01-01 15:41:49
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MAIZE

我赞同用单酶切来的实际，载体单酶切后去磷酸化，连片断，然后寻找基因内部我载体上的酶切位点来确定方向。
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4楼2009-01-02 16:49:29
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安静的位置i

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by charon1982 at 2009-1-1 13:53:
提供一个思路，你用这两个酶来切，在你的基因片段前加上这两个酶切位点，做一个酶的梯度实验，酶切的时候，有可能出现三种情况，一是两个都切开，其次是分别切开其中的一个位点，这时根据你的基因大小判断你酶切目 ...

关键是质粒上要插入片断的位置已经有另一个外源基因，我必须先双酶切去掉它，才能再插入我的外源片断。这样就没办法单酶切了啊。
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5楼2009-01-02 21:48:05
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
很简单
把质粒上的那个外源基因，双酶切，搞掉，然后补平质粒，去磷酸
然后，你要插入的片段用高保真酶扩（没有A突出），引物也不用设置酶切位点和保护碱基了，直接连平端
使用好一点的T4连接酶，绝对没问题~~~
平端我也就连个1小时就好了，用好的酶
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6楼2009-01-02 22:14:50
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader
用Gateway试剂盒，省很多麻烦

[ Last edited by sutao1979 on 2009-1-3 at 01:12 ]
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会当凌绝顶，一览众山小
7楼2009-01-03 01:09:56
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
用PCR消除目的片段上的酶切位点也很快
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8楼2009-01-03 09:11:17
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by sutao1979 at 2009/1/3, 01:09:
用Gateway试剂盒，省很多麻烦

[ Last edited by sutao1979 on 2009-1-3 at 01:12 ]

但要质粒有那两个位点才行
是很方便~~~
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9楼2009-01-03 09:54:27
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