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求助:基因枪轰击洋葱表皮细胞的具体方法
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| 求助基因枪轰击洋葱表皮细胞的具体方法,最好有详细的步骤,所需质粒的浓度和量.急!急!谢谢 |
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trh(金币+5,VIP+0):可能我没说清楚哦,是材料的准备,需要哪些溶液等具体操作步骤,实验操作方法,不是原理
trh(金币+5,VIP+0):可能我没说清楚哦,是材料的准备,需要哪些溶液等具体操作步骤,实验操作方法,不是原理
| 其具体操作是将直径4um左右的钨粉或其它重金属粉在外源DNA中形成悬浮液，则外源DNA会被吸附到钨粉颗粒的表面，再把这些吸附有外源遗传物质的金属颗粒装填到圆筒状弹头的前端，起爆后，弹头加速落入枪筒，在枪筒口附近被挡住，而弹头前端所带的钨粉颗粒在惯性作用下脱离弹头，以高速通过1mm的小孔直接射入受体，其表面吸附的外源DNA也随之进入细胞。也可以用高压放电或高压气体使金属粒子加速。这一方法与微注射法相比，具有一次处理可以使许多细胞转化的优点，受体可以是植物组织也可以是细胞。 |
2楼2008-12-31 11:03:08
3楼2008-12-31 11:55:33
jiaminl
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该法又称粒子轰击(particle bombardment)，高速粒子喷射技术(High-velocity particle microprojection)或基因枪轰击技术(gene gun bombardment)，是由美国Comel大学生物化学系John.C.Santord等于1983年研究成功。并在1987年，Vlein首先报道了应用此技术将TMV（烟草花叶病毒）RNA吸附到钨粒表面，轰击洋葱表皮细胞，经检测发现病毒RNA能进行复制，并以同样技术将CAT(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)基因导入洋葱表皮细胞。现在，该技术已在烟草、水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上成功。 这一方法是依靠一种基因枪来帮助导入外源基因。基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。它具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，实验费用低等优点。对于农杆菌不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的局限。基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系。 基因枪法： 将直径4um的钨粉或金粉在供体DNA中浸泡，然后用基因枪将这些粒子打入细胞、组织或器官中，具有一次处理多个细胞的优点，但转化效率较低，另外这种方法也用于基因治疗和抗体制备，并已取得初步成效。 |
4楼2009-01-01 16:14:52
jiaminl
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5楼2009-01-01 16:18:46
2004371310
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sanko211(金币+0,VIP+0):按照新版规，不标明有效期默认为15天。非常感谢谢你的提醒，您的支持是小木虫最大的动力。
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洋葱表皮细胞培养 切取约2 cm×2 cm 的洋葱表皮组织置固体平板培养基上，28℃弱光下预培养4~6 h，然后利用基因枪进行目的基因的转化。固体平板培养基为4 类：( 1 )MS 培养基；( 2 )MS 培养基附加0.2mol•L-1山梨醇和0.2 mol•L-1甘露醇；(3)MS培养基附加250 和500 mmol•L-1 NaCl；(4)MS 培养基附加15% 和30% 的PEG6000 。每种处理2 皿，重复3 次。 基因枪转化 取钨粉(F 1.2nm)悬液(60 mg•mL-1) 50 微升，依次加入5微升质粒DNA、50 微升 2.5 mol•L-1 CaCl2、20微升 0.1 mol•L-1亚精胺，充分混匀后静置10 min，18 000×g 离心5 s，弃上清。加入250 微升 无水乙醇振荡3 min，静置5 min，18 000×g 离心5 s，弃上清。加入60微升 无水乙醇并悬浮沉淀，每枪取12微升混合悬液。采用BiolisticPDS-1000/He基因枪进行轰击，可裂膜片压力为1100 Pa，每皿轰击2 次。 我做过这个实验，有需要的话可以发相关的文献资料给你，不过记得要给我金币哦  |
6楼2009-01-02 15:17:45