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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 蛋白挂不上柱子
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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一粒儿糖

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白挂不上柱子 已有6人参与

求大神指点，蛋白纯化了一个月了，还是没有出来，蛋白是多聚体，表达在上清里，表达量还可以，蛋白等电点4.7上下，镍柱挂不上，q柱和Sp柱，疏水柱也挂不上，q柱流穿里有，但是量少，硫酸铵沉淀是复溶后上清里量也很少
Q柱2
缓冲液Tris-HCl
Ph：8.0   20mM  Tris-HCl
电导：1.53
蛋白：
Ph：8.0   20mM Tris-HCl
电导：1.3


sp柱
缓冲液PB
Ph：6.56  20mM PB
电导：1.89
蛋白
Ph：6.56  
电导：1.57
1ml蛋白+4ml H2O
洗脱：500mMNaCL+20mMPB
1MNaCL+20mMPB
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平凡。。。。
1楼 2017-03-23 10:19:45
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walking dead

金虫 (小有名气)

填料制备和蛋白纯化专家

【答案】应助回帖

“q柱流穿里有，但是量少”啥意思？Q柱子到底挂没挂柱？首先你目标蛋白等电点是4.7，这个时候就不要用SP了，无意义。pH大于pI，带负电荷用SP肯定不挂柱。建议你可以再用DEAE试试。试剂配置准确，样品溶解在平衡液里，保持缓冲液的电导蛋白溶液电导一致。上样前充分平衡，上样流速放慢，讲道理是不会不挂柱的。你的表达蛋白有his标签用Ni柱的话，也要注意你的缓冲液，咪唑浓度和pH。祝你顺利。
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11楼2017-08-03 16:14:16
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liaohongjun

铁虫 (小有名气)
Q柱，降低上样流速！检查样品pH,电导是否与平衡缓冲液一致！SP柱平衡缓冲液pH都已经高于目标蛋白等电点了！肯定挂不上去！

发自小木虫Android客户端
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2楼2017-03-23 11:47:36
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fexcths

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
“表达在上清里，表达量还可以”从这句我大概判断出你这是工程菌表达的。那么请确认你的的载体蛋白，因为NI柱是纯化含有HIS标签的蛋白的。 如果是含HIS标签的蛋白，那么你挂不上ni柱可能是有两点：一是buffer，这需要你多多尝试，二是柱效不行了，这就需要你做一下再生了
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3楼2017-03-24 09:23:35
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fexcths

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

链接: https://pan.baidu.com/s/1qY0Mpoo 密码: what 希望对你有用。
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4楼2017-03-24 09:42:34
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