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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 有关用primer5设计引物的几个问题
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提剑的书生

新虫 (小有名气)

[交流] 有关用primer5设计引物的几个问题

1、克全长时在3端设引物想增删碱基该怎么操作啊
2、如果实在不能保证三个都是none，哪一个或者那几个可以接受是红色found
3、上下游引物退火温度差太大了怎么办
4、引物长可能超过25可以接受吗

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1楼 2017-03-18 14:56:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

781055707

木虫 (著名写手)
★
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我老师就教我去下primer5,然后让我去文献上找人家设计的成功引物，自己分析。你下个十几篇引物分析下就明白了。
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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2017-03-18 16:33:57
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肖申克的舅叔

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-03-18 21:10:24
1，点击那个引物好像就可以编辑了，2，其实红色不红色都可以，尽量不要出现全部红色的。3，相差太多不太好，我觉得四度应该也可以用，有时候我的引物也这样。4，二十八九三十都是可以的。很难有完美的引物，一般那个评分是根据你的参考序列开设计，其他的基因也是可能造成错配的，尽量注意消除引物之间的差异就是了

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2楼2017-03-18 15:27:05
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bestzdz

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2017-03-19 09:09:50
1.点编辑就可以增减碱基，注意方向。
2.红色不一定是问题，要看对应的能值，绝对值一般不要超过9就好。
3.调整引物的长短和GC含量来调整Tm值，一般引物越长、GC含量越高则Tm值越高。
4.一般不要超过28，20左右最佳。
另外一点个人体会：引物的选择首要因素是特异性，要加强搜索。在特异性上PP5存在很大问题，往往设计出来的引物扩增时会有很多杂带。只要特异性好，引物的二级结构倒不是大问题。
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学海无涯，乐在其中；谨言慎行，惜时自勉！
5楼2017-03-18 23:58:28
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bestzdz

金虫 (小有名气)
★
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7楼: Originally posted by 提剑的书生 at 2017-03-19 00:28:18
我一编辑，上游还好，下游已删除碱基就不能一一对应了，增加也不知道如何增加
...

增减之后点Analyze,然后点Prime,再点OK就可以
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学海无涯，乐在其中；谨言慎行，惜时自勉！
8楼2017-03-19 11:00:18
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bestzdz

金虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
6楼: Originally posted by 提剑的书生 at 2017-03-19 00:26:37
我也觉得pp5不好，退货温度好像也有问题偏低，你是用什么软件设的orf引物呀
...

可以到NCBI上的引物设计板块进行搜索。
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学海无涯，乐在其中；谨言慎行，惜时自勉！
9楼2017-03-19 11:38:46
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普通回帖

提剑的书生

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by 肖申克的舅叔 at 2017-03-18 15:27:05
1，点击那个引物好像就可以编辑了，2，其实红色不红色都可以，尽量不要出现全部红色的。3，相差太多不太好，我觉得四度应该也可以用，有时候我的引物也这样。4，二十八九三十都是可以的。很难有完美的引物，一般那个 ...

因为点开下游引物增删就不能包含终止子了

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3楼2017-03-18 16:04:41
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提剑的书生

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by bestzdz at 2017-03-18 23:58:28
1.点编辑就可以增减碱基，注意方向。
2.红色不一定是问题，要看对应的能值，绝对值一般不要超过9就好。
3.调整引物的长短和GC含量来调整Tm值，一般引物越长、GC含量越高则Tm值越高。
4.一般不要超过28，20左右最 ...

我也觉得pp5不好，退货温度好像也有问题偏低，你是用什么软件设的orf引物呀

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6楼2017-03-19 00:26:37
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提剑的书生

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by bestzdz at 2017-03-18 23:58:28
1.点编辑就可以增减碱基，注意方向。
2.红色不一定是问题，要看对应的能值，绝对值一般不要超过9就好。
3.调整引物的长短和GC含量来调整Tm值，一般引物越长、GC含量越高则Tm值越高。
4.一般不要超过28，20左右最 ...

我一编辑，上游还好，下游已删除碱基就不能一一对应了，增加也不知道如何增加

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7楼2017-03-19 00:28:18
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meng蓝色桃子

新虫 (初入文坛)
★
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刚才用primer5设引物，这个序列引物超级烂，几乎那4个全都是红色found，不知道该怎么办了

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10楼2017-04-02 13:00:10
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