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xiyicui

金虫 (小有名气)

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[交流] 10金币求助——真菌纯化培养操作

各位虫虫好，请帮忙传授一下真菌纯化的具体操作：
比如用什么工具？
怎样操作？
注意什么事项？
纯化几次？
纯化到菌落是什么样的程度，才算纯化？
谢谢：）

[ Last edited by xiyicui on 2008-12-26 at 15:29 ]

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1楼 2008-12-26 11:37:14

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johnsionzhang

银虫 (小有名气)

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有关真菌的培养鉴定

★ ★ ★
spadeJ(金币+3,VIP+0):

FF 鉴定使用
FF鉴定板适合鉴定新鲜的培养物，对于在斜面培养基上长久保存或经过多次转代的培养物，常会使表型恶化，或会失去该菌株的生理代谢特征。

利用吲哚硝基四唑紫（Iodonitrotetrazolium violet）作为颜色指示剂显示利用特定碳源发生氧化反应时线粒体的活性。
分离物先在培养基上培养，利用加有特定“胶质”的FF-IF接种液达到一定浓度。100ul菌悬液，常包含孢子和菌丝片断，被接到FF鉴定板。当培养时，会利用孔中的碳源，会发生下列某一个或两个变化：1线粒体活性增加，形成微红-橙色颜色，在490nm峰值增加。2 生长迅速，浊度增加，同时在490nm和750nm处峰值增加。A1 孔不含碳源，同时作为颜色色度和浊度的参照孔。
鉴定板一般培养1-4天。利用读数仪在490nm和750nm检测定量每孔的颜色和浊度反应。biolog软件自动与数据库比对。寻找符合条件的结果。

注意事项：
1 必须是纯的培养物
2 接种前，菌株依据不同的生长条件产生不同的代谢图谱，参见“样品制备”
3 必须无菌操作，污染会影响结果
4 尽量用一次性的玻璃器皿处理菌悬液和溶液，冲洗的器皿可能会残留肥皂或清洁剂会对培养物产生毒害。
5 用之前使FF-IF接种液和鉴定板恢复到室温。
6 仔细校正比浊仪，使菌悬液浓度达到特定浓度范围。
7 处理所有真菌，一定在无菌间操作，避免污染。
尤其是避免空气中的孢子（一些分生孢子）产生交叉污染。避免仪器和/或人为的污染。推荐使用II级生物安全柜。
干净，无菌的可替换鉴定板盖有助于减少对读数仪的污染风险。
8 biolog的化学试剂包含对光和温度敏感的成分。

材料
2%ME 培养基：2%麦芽汁培养基（20g麦芽汁干粉培养基，Oxoid®货号#LP0039B；18g细菌级琼脂；1L无菌水）或2%平板培养基（BIOLOG货号#71106）

FF-IF：无菌的一次性玻璃（硅硼酸盐）管，20ml容量（规格20×160mm）含有16ml无菌的带有“胶质”的接种液。制备FF-IF接种液步骤如下：
将蒸馏水煮沸，将Phytagel加入至2.5g/l（Sigma® Chemical,
cat # P8169，Tween 40至0.3g/l(Sigma Chemical, cat # P1504)搅拌直到所有化合物溶解，溶液变清，这个过程不需要继续加热。倒入16ml于管中，然后灭菌即可。

鉴定板盖：Gamma 辐照处理的Gamma材料鉴定板盖（BIOLOG订货号30201）

使用FF- IF接种液前反复颠倒或轻轻震荡使里面的“胶质”混匀。
使鉴定板和FF-IF接种液恢复到室温。
步骤
1 在2%ME培养基培养菌株
利用推荐的培养基培养。
培养温度一般是20-26℃
2 样品制备
丝状真菌
在2%ME琼脂上培养（该培养基利于产孢子）
将接种的平板培养基放到温和光照下或紫外灯下培养，直到产孢，一般在26度需要5-10天
许多真菌在温和光照下产生大量的分生孢子（无性孢子）。一些真菌种群，植物病原真菌如镰刀霉需要在紫外光下培养以提高产孢。
酵母（丝状）
在2%ME琼脂上培养酵母，26度培养24-48h

3 制备菌悬液
校正浊度仪，利用GN/GP-IF接种液调整100%，然后用FF的标准比浊管显示浊度，应为75%T左右。进行读数校正时最好不要随意转动接种液的玻璃管，因管壁的透光度不均匀，转动会发生变化，空白校正时在什么位置，接种时尽量也放在同样的位置。

在II级生物安全柜中制备菌悬液并接种。首先将棉棒在接种液浸一下，然后在平板表面滚动粘取孢子，上下反复涂抹接种液上部干燥的管壁上，使孢子分散，然后利用接种液冲下做成均一孢子悬液。将孢子悬液浓度控制在标准浓度上下2%之内。
将其倒入v型槽，迅速接种到鉴定板。最好不要超过10分钟，一些菌以接种液的形式保持太久会因无氮源而失去代谢活性。

4 培养鉴定板
将板放入密闭的盒或袋内，不需要在其中加增湿剂因随着菌丝生长这样易于污染鉴定板的外部。
26度，大约需培养鉴定板1-4天，每天读板，选取相应的时间。
生长较慢的菌或耐渗透压的菌可能需要培养10天左右才能得到结果。
培养基 2%ME（麦芽汁培养基）
湿法制备菌丝体酵母（菌丝状）
微生物类型丝状真菌酵母
培养基 2%ME 2%ME
温度 26℃ 26℃
气体状况空气空气
培养时间 5-10天 2天
接种液 FF-IF FF-IF
浊度管 FF FF
接种浊度 75%T 75%T
接种量（ul/孔） 100 100
培养时间（H） 24，48，72，96 24，48，72，96

结果
1 读数仪利用490nm（测定微红-橙色颜色）和750nm（测定浊度）
2 对于一些菌会在碳源缺失时芽孢（spore）或分生孢子（conidia）发芽在A1孔产生颜色。鉴定
软件可以容许这种“假阳性”
3 大多数菌可以产生清晰，可辨的“阳性”颜色反应。但一些属即使是“阳性”反应也产生浅的微红-橙色。
4 第1天，SIM阈值0.9，
第2天，SIM阈值0.7
第3天，SIM阈值0.65
第4天，SIM阈值0.6
5 食品food和空气air数据库分别包括了所有常见食品和空气中真菌，里面有酵母，曲霉，青霉，和其他属。
6 每天读板直到获得鉴定结果，一般需要4天。一旦获得了鉴定结果，就不需要再读板。
一些耐渗透压和其他生长缓慢的真菌需要更多时间培养和读数，可能还要读7天。
7 通过比较真菌可利用的图片库提供的孢子（microscopic）和菌落（macroscopic）形态，确认所鉴定的真菌菌株。利用first choice(第一选择)的图片与所鉴定的真菌的孢子和菌落形态比较，看是否相符。其次，比较第二，第三选择提供的图片，用以确认。
8 如果4天后仍得不到鉴定结果，选取前三位的菌利用其图片库提供的孢子和菌落形态与所鉴定菌进行对比确认。
9 选择正确的数据库来鉴定真菌非常重要。如果分离的真菌来自空气样品，则选air database，同样地，如果来自于食品样品，则选择food database。
10 如果真菌已经鉴定到某种属，则选特定属数据库，其数据库包含的真菌更集中，包含air 和food数据库没有的菌株。
11 酵母细胞悬液包含酵母的活体细胞，24h可以产生有用的图谱。与之相比，丝状真菌的悬液是芽孢（spore）或分生孢子（conidia）悬液，它必须萌发生长后才能产生图谱。孢子萌发所需时间不一致，24h产生的图谱也有很多种，真菌在24h时图谱的可信度也会下降。

Trouble shooting
所有的孔均为阳性：
1 用非污染的纯菌。非真菌菌株可能使孔全部呈阳性反应
2 不要将培养基N源挑进接种液中。
3 接种浓度不要超过特定浓度范围
4 A1 孔作为参照孔，不要少加接种液，应与其他各孔保持一致。希
所有孔均为阴性：
1 确保菌株适合用FF鉴定板鉴定（产孢真菌，食品或空气中酵母）
2 所鉴定真菌要在推荐的培养基上新鲜培养
3 确保接种液准确制备，不要含有防腐剂。
4 26℃培养
5 达到规定的接种浓度
6 A1 孔作为参照孔，不要加入过多，与其他孔保持一致。

FF鉴定板适用于新鲜培养，分离纯化的产孢真菌。只能鉴定包含在数据库中的菌株，不包括在内的真菌菌株将报告为“NO Identification”. 非典型菌株也可能在培养4天后SIM低于0.6。一些保存较久的真菌经多次转代培养后也可能会改变代谢特征，报告为NO identification。

质控
1  Galactomyces geotrichum  (Geotrichum  candidum) ATCC 34614 白地霉
2. Aspergillus  niger ATCC 16404 黑曲霉
3. Cladosporium  cladosporiodes DAOM 226449 枝孢样枝孢
4. Penicillium  chrysogenum ATCC 10106 产黄青霉