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ELISA实验 不同稀释度抗体 OD值差别不大，原因为何，请教各位大神 已有6人参与
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初步接触ELISA实验，最近以不同浓度的PCT抗体（鼠抗）（空白、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）包被酶标板（高吸附），封闭、洗涤等步骤后，加入不同稀释度的HRP羊抗鼠IgG，建议稀释度为1:3000，因此选1:2000、1:3000、1:4000作为不同梯度进行实验。后续加入TMB显色液、终止液后，OD值结果如附件图所示。 具体实验操作如下： 1. 不同浓度的PCT抗体（PBS缓冲液），均取100微升包被于96孔板中，4℃过夜； 2. PBS洗涤3次（300μl），每次3min (但由于没有300微升的排枪洗头，所以一个孔一个孔加的，所以可能不只浸泡3min,不知会不会有影响)。后封闭（2%BSA的PBS溶液）37℃下2h; 3. PBST（0.05% Tween 20的PBS溶液）洗涤5次（300μl），每次3min，拍干； 4. 加入HRP羊抗鼠IgG，不同稀释度（1:2000、1:3000、1:4000）（稀释液为PBST），每孔100μl，37℃孵育1h; 5. PBST（0.05% Tween 20的PBS溶液）洗涤5次（300μl），每次3min，拍干； 6. TMB显色液，每孔100μl，37℃1h; 7. 加入2M 硫酸，每孔50μl，室温静置5min后于酶标仪中450nm波长下检测OD值； 因为是第一次做ELISA实验，本次实验是打算通过不同抗体稀释度包被，获得具有一定比例的OD值，验证实验操作无误并获得抗体浓度与HRP标记抗体的关系。后续打算再进行包被PCT抗体-PCT抗原-HRP羊抗鼠IgG，通过与上述实验对比，通过OD值的下降验证包被PCT抗体-PCT抗原的结合；最终再利用棋盘滴定法，通过包被PCT抗体-PCT抗原-HRPPCT抗体获得优化的抗体浓度。不知自己的实验思路合不合理？ 同时，从此次实验结果上看： 1. 空白处OD值是不是理应在0.1以下，我这个这么高的值正常吗？实验可以看出显淡黄色； 2. 随着抗体浓度增加，OD值先下降在上升，而且幅度很小，几乎看不出太大变化； 3. 随着HRP抗体稀释度变大，OD值也无明显变化； 不知是什么原因导致的。想请各位专家大神给些指导，感激不尽！谢谢！  截图00.jpg |
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yyy0305
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我建过不少ELISA定量的方法，要做到pg级别的定量难度还是挺大的，你先试试吧，做好长期战斗心里准备，BD公司有一些这个灵敏程度的试剂盒，建议你看看有没有你需要的。 发自小木虫Android客户端 |
4楼2017-03-02 18:49:43
yyy0305
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有这几点你得注意下： 1. 空白处OD值是不是理应在0.1以下，我这个这么高的值正常吗？实验可以看出显淡黄色； 这是你在包被完成洗板后未进行封闭导致的，酶联抗体非特异吸附在了板子上，建议你用3%BSA进行封闭 2. 随着抗体浓度增加，OD值先下降在上升，而且幅度很小，几乎看不出太大变化； 3. 随着HRP抗体稀释度变大，OD值也无明显变化； 这两点是因为你包被抗体PCT抗体（鼠抗）已经饱和了，板子的载量有限导致的。 按照你的实验目的我建议你用5μg/ml的PCT抗体直接包被酶标板条，封闭好后PCT抗原直接做梯度稀释，浓度从1000ng/ml，两倍梯度稀释，10-12个点，在加入合适浓度的HRPPCT抗体坐着试试看 |
2楼2017-03-02 12:46:59
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linyingjia
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