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酶切、连接、转化再次求助
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前次问过大家。这次有些更具体的问题。 （1）酶切的时候，一般vector和PCR产物分别加入多少ng？ （2）酶切的时间一般是多长？37°过夜会不会不好？ （3）连接反应，我计划加入300ng DNA和100 ng vector，是否足够？ （4）如果我的连接如上，转化的时候，应该加入多少的总DNA？ 谢谢！ |
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figo.339
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3楼2008-12-20 09:26:28
三磷酸腺苷
铁杆木虫 (职业作家)
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forget1997(金币+2,VIP+0):三磷酸腺苷 是克隆专家啊！
forget1997(金币+2,VIP+0):三磷酸腺苷 是克隆专家啊！
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（1）酶切的时候，一般vector和PCR产物分别加入多少ng？------越多越好。当然不要超过酶的消化能力，不超过1~2ug。 （2）酶切的时间一般是多长？37°过夜会不会不好？--------NEB一到两个单位的酶1h以内可以消化1~2ug DNA。看酶切体系。过夜不好，星号活性。 （3）连接反应，我计划加入300ng DNA和100 ng vector，是否足够？----------看摩尔比而不是质量比，Vector：Insert=1：3~10。我喜欢1：5 （4）如果我的连接如上，转化的时候，应该加入多少的总DNA？--------连接体系一般也就10ul~20ul。一般就直接丢10ul进去了。fmol级别的都能有克隆出现，主要看转化效率。 |
2楼2008-12-20 09:22:49
charon1982
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4楼2008-12-20 12:24:35
zhijiangli
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5楼2008-12-22 12:10:35