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forget1997

银虫 (小有名气)

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[交流] 酶切、连接、转化再次求助

前次问过大家。这次有些更具体的问题。
（1）酶切的时候，一般vector和PCR产物分别加入多少ng？
（2）酶切的时间一般是多长？37°过夜会不会不好？
（3）连接反应，我计划加入300ng DNA和100 ng vector，是否足够？
（4）如果我的连接如上，转化的时候，应该加入多少的总DNA？
谢谢！

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1楼 2008-12-20 08:34:48

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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

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专业: 神经系统肿瘤（含特殊感受

★ ★
forget1997(金币+2,VIP+0):三磷酸腺苷是克隆专家啊！

（1）酶切的时候，一般vector和PCR产物分别加入多少ng？------越多越好。当然不要超过酶的消化能力，不超过1~2ug。
（2）酶切的时间一般是多长？37°过夜会不会不好？--------NEB一到两个单位的酶1h以内可以消化1~2ug DNA。看酶切体系。过夜不好，星号活性。
（3）连接反应，我计划加入300ng DNA和100 ng vector，是否足够？----------看摩尔比而不是质量比，Vector：Insert=1：3~10。我喜欢1：5
（4）如果我的连接如上，转化的时候，应该加入多少的总DNA？--------连接体系一般也就10ul~20ul。一般就直接丢10ul进去了。fmol级别的都能有克隆出现，主要看转化效率。