| 查看: 977 | 回复: 3 | |||
[交流]
免疫亲和纯化技术 已有2人参与
|
|
1 . 将抗体结合到蛋白A或蛋白G微珠上。对于一般用途的层析柱，每毫升湿的微珠大约可以结合2mg单克隆抗体或亲和纯化的多克隆抗体。将抗体和蛋白A或蛋白G微珠混合制成稀薄的匀浆，在总量为10ml的溶液中加入大约lml微珠，室温孵育1h，轻轻摇动混匀。 2． 用10倍体积的0.2mol／L硼酸钠（pH9.0）洗涤微珠2次，每次以3000g离心2rain或10 000g离心30s。 3． 用10倍体积的0.2mol／L硼酸钠（pH9.0）重悬微珠，留取相当于10t~l湿微珠的样品。加入足量的二甲基庚二酸酯固体至微珠匀浆中，使终浓度为20mmol／L。 4． 室温孵育30min，并轻轻混匀。留取相当于10t~l偶联微珠的样品。 5． 用0.2mol／L乙醇胺pH8.0．洗涤微珠1次以终止反应。然后重悬于0.2mol／L乙醇胺，室温孵育2h，轻轻混匀。微珠用PBS洗涤后，重悬于PBS，加入硫柳汞保存。 6． 将偶联前和偶联后的微珠样品加入Laemmli样品缓冲液中煮沸后，检查偶联效果。分别取相当于1ul和9ul 2份样品在10％SDS—聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并用考马斯亮蓝染色，偶联效果良好时，在偶联前的微珠样品中显示一条55kDa的重链带，而偶联后的样品无此区带。 7． 将抗体包被的微珠转入合适的层析柱中，用PBS冲洗容器收集残留的微珠。如果可能，仅使用结合制品中全部抗原所需的抗体微珠基质。 8． 用20倍柱床体积与制备抗原相同的缓冲液洗柱。 9． 将抗原液加到柱上，按每毫升柱体积大约lml／h的速度使抗原溶液流过层析柱，可以用一台蠕动泵控制。 10． 用20倍柱床体积的结合缓冲液（PBS）洗柱。 11． 用20倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱，建议使用预洗脱缓冲液。 12． 采用分段洗脱法，连续以0.5倍柱床体积的洗脱缓冲液通过层析柱，分管收集每一组分。如果用过高或过低pH值的缓冲液洗脱，收集管内需加入0.1倍柱床体积的缓冲液。 13． 检测每管的抗原含量，将浓度高的各管合并。根据抗原的用途，需对获得的蛋白洗脱液透析以改变缓冲液。 14． 用20倍柱床体积的起始缓冲液流经基质，使层析柱再生。加入0.01％硫柳汞可长期保存（4℃）。 |
回复此楼» 猜你喜欢
职称评审没过，求安慰
已经有54人回复
-
垃圾破二本职称评审标准
已经有19人回复
-
毕业后当辅导员了，天天各种学生超烦
已经有5人回复
-
26申博自荐
已经有3人回复
-
A期刊撤稿
已经有4人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 蛋白质纯化亲和层析分离技术
已经有50人回复
- 蛋白质纯化与鉴定实验指南[l冷泉港]中译本
已经有661人回复
- 【分享】蛋白质纯化个人总结2
已经有38人回复
- 分子克隆实验指南系列之：美国冷泉港实验室经典:抗体技术实验指南
已经有10人回复
2楼2017-02-23 17:35:43
3楼2017-02-27 09:45:24
4楼2017-02-27 12:11:59