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glzeng金虫 (小有名气)
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[交流]
求助：生物活性测定（10金币）介绍一下哪里可以做这个实验
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这是在一片专利上看到的，我把它翻译了一下，其实我自己也不完全看得懂，我不是做生物方面，所以拜托一下各位，看能不能介绍一下这个实验在哪里可以做！ 实验目的： 测定GA RS相对 GA DS的相对生物活性 实验方案： 免疫 制备GA RS溶液 准确称取15mg GA， 溶解在无菌PBS中制备5mg/ml的溶液 制备GA RS乳状液 等体积GA RS溶液(5mg/ml)和CFA混合，混合物转移至无菌玻璃注射器，注射器通过Luer bridge与另外一只玻璃注射器相连。通过在两只注射器之间的相互转移而使其充分乳化。稳定乳状液的定义是在水面上乳状液不分散。 注射： 将GA RS乳状液转移至胰岛素注射器，将100µL GA RS乳状液注射到小白鼠的四只脚掌(footpads)上(每只约25µL), 免疫的小白鼠用于体外实验（9-11天） 制备初级培养的LN细胞 初级培养的LN细胞的取自免疫9-11天的小白鼠。手术之前在净化罩/柜中将紫外灯打开20min，手术开始时关闭。在将试剂放入净化罩之前用70％乙醇溶液清洁工作台面。 制备Enriched DCCM1 medium，Enriched DCCM1 medium和RPMI medium在使用前预热至37℃，将小白鼠杀死后（扭断脖子）固定在支撑平台上，背部着地。腹部用70％乙醇消毒后切开一个中等大小的口子，（切口长度通常为2 cm），将LN转移至含有约5ml无菌RPMI medium的无菌培养皿中，LN细胞悬浮液用无菌注射器从培养皿转移至50ml 无菌试管。 细胞计数： 装有细胞悬浮液的无菌试管中加入RPMI medium至40ml，LN细胞在室温下离心分离（200×g）10min，固体重新分散在40mlRPMI中，Two aliquots of 50µL were drawn each from the cells’ suspension diluted 4-fold with 150µL of 0.1% Trypan blue（锥虫蓝） in a microtest well. The aliquots were mixed wel by pipetting gently up and down。用盖玻片覆盖血球计，将两个aliquot用50－200µL的移液管移入血球计的上下两个chamber中，混合物（细胞悬浊液和锥虫蓝）可在chamber中放置两分钟，并可以覆盖整个chamber的表面，如果chamber中出现气泡或者过量则需将血球计完全清理干净并干燥后重新上样。活的细胞不能与锥虫蓝结合而呈现无色状态，死细胞则与锥虫蓝结合而显蓝色。计算细胞计数板中央方格中的活细胞数目，方格中边缘的细胞只有当细胞全部在方格中才计数，细胞密度通过下面的公式计算： Average number viable cells(both chambles) ×4×104＝cells/ml 将LN细胞在室温下离心分离（200×g）10min，固体分散在enriched DCCM1中,形成密度为1×107 cells/ml的溶液。 体外生物测定 体外生物测定在Flat-bottomed 细胞培养测试板上进行，最终体积为1ml 制备GA RS校正曲线 一个aliquot的1 mg/ml GARS用enriched DCCM1 medium稀释至100 µg/ml(10倍)，用0.2 µ 醋酸纤维素过滤，制备6个浓度为2-50 µg/ml的enriched DCCM1 medium和GA RS溶液。 制备稀浓度GA DS溶液 准确称取10-20 mg GA DS溶解在ddH2O中制备1.2 mg/ml的溶液，光学密度（OD）在275 nm处测定。OD值调至1.03，制备1 mg/ml溶液，然后用DCCM1配成100 µg/ml溶液，用0.2µ醋酸纤维素过滤，该溶液稀释至10和20 µg/ml，如上表。 测定反应： 下面这些溶液加入到24格细胞培养测试板 GA RS 0.5 ml LN细胞（最后密度如：5×106 cells/well），每个GA RS稀释液0.5 ml，在格中的最后浓度为：25，15，10，5，2.5，1 µg/ml。 GA DS样品 0.5 ml LN细胞（最后密度如：5×106 cells/well），每个GA DS稀释液0.5 ml，在格中的最后浓度为：5，10 µg/ml。 每个测试都包含如下控制： 1） 负控制－ 用控制肽培养LN细胞 0.5 ml LN细胞（最后密度：5×106 cells/well） 0.5 ml MBP肽溶液（20 µg/ml）用DCCM1稀释（最后浓度为10 µg/ml） 2）正控制－用Con A（非特异性T细胞刺激剂）刺激LN细胞 0.5 ml LN细胞（最后密度：5×106 cells/well） 0.5 ml Con A（5 µg/ml）用DCCM1稀释（最后浓度为2.5 µg/ml） 细胞密度随着他们对GA的反应而发生变化。培养条件为37 ℃，湿度5％CO2保温箱中18-21 h，测试板在室温下离心10 min（200×g），上清液转移至低温管中，在－20℃下可保存一星期。 酶联免疫吸附测定（ELISA）白介素-2检测 所有样品测定次数为三次，每个plate都包含以下： 1） 白介素-2标准曲线－包含至少6个非零浓度白介素-2 2） 空白＋第一个抗体，没有白介素-2 standard，＋第二个抗体（零点） 3） GA RS培养媒介,测试样品用DCCM1稀释，方法如下 a) 1, 2.5 µg/mlGA RS 样品以及反控制样品稀释2倍 b) 5-25 µg/ml GA RS 样品和测试样品稀释5-10倍 c) 正控制样品(Con A)稀释15-20倍 测定白介素-2水平的ELISA方案按照制造商提供的方法进行，如果待测样品的OD值超过或低于Plate reader的极限值，则样品需重新配置后进行分析。 计算和可接受标准 酶联免疫吸附测定 实例2 实验2A：GA RS 特异性T细胞分泌的细胞因子 用250 µg/mlGA RS/CFA对雌性F1老鼠免疫9-11天，将LN细胞提取出来后用不同浓度GA RS培养18-24 h，培养条件为为37 ℃，湿度5％CO2保温箱中。接下来取其离心上清液用于细胞因子测定。 用对细胞因子和链霉抗生素蛋白－素辣根过氧化物酶具有特异性的生物素化抗体进行酶联免疫吸附测定。每个plate包括空白控制（第一个和第二个抗体不含细胞因子标准品），质量控制（QC）样品（三个浓度在测试线性范围内的细胞因子标准品）。每个体外测试包含一个正控制（Con A，非特异性T细胞刺激剂）和一个负控制（不含GA或其他抗原），所有细胞因子的测试都在培养18-24 h以后。TGF-β,IL-10和IL-4水平在培养72小时后再次测定。结果如下： （-）小于检测限，（+）达到约400 pg/ml，(++)大于400 pg/ml。表中数据表明，在GA RS的刺激下，LN细胞分泌出IL-2，INF-γ，IL-10和IL-6，但是TNF-α，IL-4，IL-13，TGF-β则未检测到。表明GA RS 特异性T细胞分泌的细胞因子是TH0型的。 由于分泌的IL-2与GA RS 具有很好的重现性及线性关系，所以IL-2是衡量T细胞激活的最佳细胞因子。 实验2B：优化免疫过程 为了优化免疫方案，设计如下实验。第一个实验测试GA RS（免疫抗原）剂量对淋巴和脾脏中的T细胞反应的影响。结果表明淋巴中T细胞分泌的IL-2比脾脏中分泌的多，因此选择初级培养的LN细胞用于测试。另外，在培养过程中，GA RS的剂量对T细胞反应没有影响。在GA RS 剂量不同的情况下，LN和脾脏细胞都能分泌等量的IL-2，这表明免疫过程是健康的，即使GA RS剂量差别很大也不影响免疫结果。 进一步优化免疫方案， 实验表明每只小白鼠注射250 µg GA RS+CFA比每只注射10 mgGA＋ICFA(较弱的辅料)要好得多。250 µg/只能很有效的Block EAE(至少80％) 特异性T细胞通常在免疫10天左右才产生，因此免疫时间为9-11天。 实验2C：优化体外实验条件 1、 培养媒介 实验中用到4个培养媒介：1）RPMI+1%NMS，2) RPMI+1%FBS，3）Biotarget，4）DCCM1(不含Serum 媒介)，其中最优的为第四个。 2、 IL－2的分泌动力学 分泌动力学表明培养时间最佳为18-21h 3、细胞因子测定 IL-2通过OptEIA(Pharmingen, Cat.#2614KI)-a ELISA kit specific for mouse IL-2，这种ELISA kit非常灵敏，结果非常精确，并且重现性高。 4、测试样品中的IL-2在－20℃下的稳定性 －20℃可保存一星期。 5、GA RS 溶液在－20℃下的稳定性 －20℃可保存5个月 实验2D: 测定GA RS 校正曲线的线性范围 实例3：实例一的证实 |
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