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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 载体构建
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丽姐萍妹

新虫 (正式写手)

[求助] 载体构建 已有1人参与

我准备将载体中的GUS切掉 插入我的目的片段 可是GUS前后的双切酶把我的载体切成了好几个片段 后期准备选用单酶切 用Pml1酶进行单酶切 可是我的片段插入到GUS的后面 表达的问题怎么解决啊？我的目的片段有起始密码子和终止密码子，这个要怎么处理啊 目的片段上的起始密码子需要去掉吗？还有GUS上的密码子呢？不懂啊 实验小白 对于这块不太清楚呢 求助！

@biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan @youlinglyw 发自小木虫Android客户端
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1楼 2017-02-08 16:14:40
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wkj5257

新虫 (小有名气)
可能你刚开始就没有分析载体的酶切位点，所以双酶切切出很多条带，如果这样，可以保证GUS后酶切位点为PmL1酶，且为单位点，过表达或沉默基因最好插入GUS前面，插入后面也不是不可以，但是不能够保证基因表达或者沉默，如果GUS前只有一个酶切位点能够选择，那就只能这样了，不用去除GUS终止密码子。

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分子生物学，未来科技的领导者
4楼2017-02-09 01:33:22
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
相当混乱，到底哪个插哪个
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2楼2017-02-08 17:18:45
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主应该是想超表达你的基因吧？

前面说用载体gus前后的内切酶切的很乱，可能是你的质粒发生了变化，楼主可以划线纯化质粒，多挑几个菌落提取质粒，做双切看是否有对的。或者从别人或别的课题要这个载体用。

再者，超表达的载体很多，不妨更换载体，避开这个问题，比你慢慢找答案快的多。

还有，一些短的标签是可以放到基因的两端的，gus我还不确定是否可以，因为它确实好大。不知道是否妨碍目的基因的功能。如果放的话，只要保证前面的基因去掉终止密码子，且不会造成后面基因发生移码，不会提前出现终止子便可。

最后，楼主早看看单酶切插入片段的方向是否和启动子是顺着的，反了也不行。

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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
3楼2017-02-09 01:08:14
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丽姐萍妹

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wkj5257 at 2017-02-09 01:33:22
可能你刚开始就没有分析载体的酶切位点，所以双酶切切出很多条带，如果这样，可以保证GUS后酶切位点为PmL1酶，且为单位点，过表达或沉默基因最好插入GUS前面，插入后面也不是不可以，但是不能够保证基因表达或者沉默 ...

我在做之前有分析酶切位点的 因为用的载体是优化过的了 所以具体序列我是不知道的 大体的我有分析过酶切位点的 那如果GUS后面插入目的片段不能表达的话 插入也没用啊 密码子不需要去除的吗？有没有做双价载体的啊 我是做植物的 你们是用什么载体呢？公司有卖吗？

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5楼2017-02-09 23:01:24
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