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丽姐萍妹新虫 (正式写手)
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[求助]
载体构建 已有1人参与
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我准备将载体中的GUS切掉 插入我的目的片段 可是GUS前后的双切酶把我的载体切成了好几个片段 后期准备选用单酶切 用Pml1酶进行单酶切 可是我的片段插入到GUS的后面 表达的问题怎么解决啊？我的目的片段有起始密码子和终止密码子，这个要怎么处理啊 目的片段上的起始密码子需要去掉吗？还有GUS上的密码子呢？不懂啊 实验小白 对于这块不太清楚呢 求助！ @biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan @youlinglyw 发自小木虫Android客户端 |
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可能你刚开始就没有分析载体的酶切位点，所以双酶切切出很多条带，如果这样，可以保证GUS后酶切位点为PmL1酶，且为单位点，过表达或沉默基因最好插入GUS前面，插入后面也不是不可以，但是不能够保证基因表达或者沉默，如果GUS前只有一个酶切位点能够选择，那就只能这样了，不用去除GUS终止密码子。 发自小木虫Android客户端 |
4楼2017-02-09 01:33:22
jurkat.1640
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2楼2017-02-08 17:18:45
yudaoqian88
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【答案】应助回帖
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楼主应该是想超表达你的基因吧？ 前面说用载体gus前后的内切酶切的很乱，可能是你的质粒发生了变化，楼主可以划线纯化质粒，多挑几个菌落提取质粒，做双切看是否有对的。或者从别人或别的课题要这个载体用。 再者，超表达的载体很多，不妨更换载体，避开这个问题，比你慢慢找答案快的多。 还有，一些短的标签是可以放到基因的两端的，gus我还不确定是否可以，因为它确实好大。不知道是否妨碍目的基因的功能。如果放的话，只要保证前面的基因去掉终止密码子，且不会造成后面基因发生移码，不会提前出现终止子便可。 最后，楼主早看看单酶切插入片段的方向是否和启动子是顺着的，反了也不行。 发自小木虫Android客户端 |
3楼2017-02-09 01:08:14
丽姐萍妹
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我在做之前有分析酶切位点的 因为用的载体是优化过的了 所以具体序列我是不知道的 大体的我有分析过酶切位点的 那如果GUS后面插入目的片段不能表达的话 插入也没用啊 密码子不需要去除的吗？有没有做双价载体的啊 我是做植物的 你们是用什么载体呢？公司有卖吗？ 发自小木虫Android客户端 |
5楼2017-02-09 23:01:24
