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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组载体准备
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vulture1206

铜虫 (初入文坛)

[求助] 重组载体准备 已有3人参与

小弟准备构建一个表达载体：使用pET-44a载体， Pst I 和Sal I内切酶。可是Novagen的说明书说用3ug的载体来消化用于连接目的基因。可是我们实验的载体是以plasmid的形式保存的，而且浓度是30ng/ul。请问大虫们，这个是要怎么整？

还有，我把载体消化、跑胶之后回收，为什么浓度会低到只有8ng/ul？我用来消化的载体量有1ug左右。乙醇沉淀没办法浓缩，已经尝试过很多次了。

求助啊……
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1楼 2017-02-06 20:03:46
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-02-07 18:23:34
不清楚你连接后转化的宿主是什么菌，对载体连接体系各成分的浓度要求这么精确么？看你用的pet载体，应该是连接转化大肠吧，这个感觉是没有必要纠结这么细节的要求，当然载体和片段酶切处理那一步保证酶切完全很重要，其他的载体回收后浓度降低很多都不是大问题呀，平时的实验中，载体2微升的电泳图可以看到有条带，隐隐约约都可以的，取1微升用于连接就可以，按说明书把握各个细节，会很纠结，并且严重影响实验效率。熟练之后，其实大家都不怎么去关注过片段的精确浓度，电泳大概估算即可。祝好。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
2楼2017-02-07 00:30:51
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-02-07 18:23:49
酶切多少量不重要，重要的是要酶切完全，并且回收之猴浓度要达到20ng/ul以上才适合连接。你的质粒浓度太低了，重新抽提。pET系列多数都是低拷贝，需要多份菌液过同一个柱子在elute，这样质粒浓度会高一些。然后再考虑酶切。
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3楼2017-02-07 15:58:53
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vulture1206

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 原海亮 at 2017-02-07 00:30:51
不清楚你连接后转化的宿主是什么菌，对载体连接体系各成分的浓度要求这么精确么？看你用的pet载体，应该是连接转化大肠吧，这个感觉是没有必要纠结这么细节的要求，当然载体和片段酶切处理那一步保证酶切完全很重要 ...

了解，我再来试试，
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4楼2017-02-08 12:51:13
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vulture1206

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2017-02-07 15:58:53
酶切多少量不重要，重要的是要酶切完全，并且回收之猴浓度要达到20ng/ul以上才适合连接。你的质粒浓度太低了，重新抽提。pET系列多数都是低拷贝，需要多份菌液过同一个柱子在elute，这样质粒浓度会高一些。然后再考 ...

准备先按所得到的浓度试一下转化，如果不行的话，就重新抽提质粒之后再去酶切。
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5楼2017-02-08 12:53:13
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
切胶回收会损失很多DNA，不必浓缩
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6楼2017-02-08 16:07:07
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vulture1206

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2017-02-08 16:07:07
切胶回收会损失很多DNA，不必浓缩

那你的意思就是，我通过切胶回收后，直接用酶来消化？
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7楼2017-02-09 18:26:46
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star013

新虫 (知名作家)
我们公司可以做载体构建

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8楼2017-02-10 17:58:09
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