用SEM观察细胞在材料表面生长的详细实验步骤

11楼2009-01-13 19:20:53

pzxao

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yusen_1982(金币+1,VIP+0):谢谢应助!

1、建议作SEM前先联系电镜室，我们这里是直接到他们那里取来戊二醛固定液，固定好即给他们送去，后续操作全部他们做。
2、激光共聚焦需要先买些标记你的细胞的带荧光的探针，这个网上都查得到，而且激光共聚焦还可以观察细胞立体骨架。
3、pbs冲洗肯定需要，一般不会冲洗掉，比如hMSC等贴壁比较好的细胞。

努力

12楼2009-01-14 21:09:35

whn732

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引用回帖:

Originally posted by pzxao at 2009-1-14 21:09:
1、建议作SEM前先联系电镜室，我们这里是直接到他们那里取来戊二醛固定液，固定好即给他们送去，后续操作全部他们做。
2、激光共聚焦需要先买些标记你的细胞的带荧光的探针，这个网上都查得到，而且激光共聚焦还 ...

这么幸福，还有人给你做，不过估计收费要贵些吧
对于荧光染色我没做过啊，不过看文献中拍出来的照片倒是很漂亮，细胞在多空材料中的空洞中都一清二楚。

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13楼2009-01-14 23:43:39

imrxxxu

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zhangwj(金币+2):谢谢参与交流！ 1-17 11:20

引用回帖:

Originally posted by whn732 at 2009-1-13 19:20:

固定之前要使用PBS冲洗材料吧？这一步的把握是不是很重要，会不会把细胞冲掉啊？
另外对于干燥方法，有文献说冷冻干燥也可以，不知道效果比临界点干燥好吗？

楼主是在钛片上养细胞，没猜错的话应该是成骨类细胞，这类细胞的贴壁不错，通常不会冲掉。
另外，没有超临界干燥设备时，冷冻或乙腈干燥效果也都可以，看个人手法吧。
ps：所谓的冲洗我理解应该叫漂洗比较合适，我一般在吸掉培养液后，培养板中加适量PBS，轻轻晃动一下（有时也不晃），弃掉PBS，重复2-3遍即可，贴壁细胞是不会损失的。

14楼2009-01-17 11:01:35

luckshelly

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yusen_1982(金币+1,VIP+0):欢迎应助，学习了 3-11 10:25

在做SEM之前，我一般是这么处理的
先用PBS洗一下，然后加入2%-5%的戊二醛固定，固定时间依样品而定，1h—1d都可以，然后再用PBS洗，再梯度乙醇脱水，最后用叔丁醇置换，冷冻干燥，喷金观察

15楼2009-03-11 10:04:36

zouqin8091

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用SEM观察细胞在材料表面生长的详细实验步骤

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wgcui(金币+2,VIP+0):欢迎多多评论！ 3-17 09:42

SEM（细胞粘附）实验方法：
1．细胞接种到材料上；
2．4,7,（3,5）天取样；
3．吸弃原有培养基；
4．加入1mLPBS培养基吹洗材料* 3次（长在材料表面的细胞不会掉）
5．吸弃PBS加入2.5-3.0% 戊二醛（固定2.5－3h）；
6．吸弃戊二醛,30%,50%,75%,80%,95%,100%(两次)梯度乙醇脱水（15min/次）；
7．在玻璃瓶中乙酸异戊酯替换（大于30min）；
8．临界点干燥后送扫描电镜观察。

SEM试验注意事项：
1.戊二醛现配现用；
2.用乙酸异戊酯替换时必须使用玻璃瓶；

########特别要注意的是，在处理的过程中材料常常会翻面，一定要记住你的细胞长在材料的哪一面，最好把材料做成特殊的形状，做好记录，观察的时候才不会浪费时间和金钱。

16楼2009-03-17 09:22:48