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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pcr扩不出来 怀疑模板问题 求助
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momimiao

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 静默人声412 at 2017-01-17 19:34:53
加10ul ，50体系的。我提的土壤都。
...

我们做的一直都是25ul体系 加5ul么 感觉有点多啊 因为DNA不纯 怕有抑制成分 _(:зゝ∠)_
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╮(╯_╰)╭
21楼2017-01-20 15:56:19
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momimiao

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
20楼: Originally posted by 太阳的电子 at 2017-01-17 19:45:05
你的实验设计有问题啊，找个质量比较好的dna样品一起上机作为阳性对照，这样就能清楚是样品问题还是体系问题了

已经进行对照了  对照没问题 有亮带的
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╮(╯_╰)╭
22楼2017-01-20 15:57:37
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Alice 2016

铁虫 (小有名气)
★
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建议重新提取模板实验，花不了多长时间的
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怕什么真理无穷，进一寸有一寸的欢喜
23楼2017-01-20 16:23:46
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清明河上

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
PCR体系按所用酶说明书配置就行，尤其模板量，要结合电泳确定DNA浓度决定加入量。试剂盒提取DNA做模板可以最终溶解到无菌水中而不用EB（同送测序的要求），模板DNA提完了跑个琼脂糖凝胶看一看质量和浓度，严格按照说明书要求用量。以理论退火温度为基准，上下各浮动五度做个梯度温度PCR，探究一下最佳退火温度。再不行试试最基础的easytaq酶看看能不能p出来。如果easytaq能p出来，改用想用的酶，各种条件完全不变，再试试看吧。电泳结果如果显示模板DNA质量不行的话，利用试剂盒或者切胶回收纯化一下。你试试看吧。如果还做不出来再分析引物设计是否合理。

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24楼2017-01-20 20:50:44
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小狼崽?

新虫 (初入文坛)
跑个胶看下模板不就好了

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25楼2017-01-21 07:44:48
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xj0612

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引物，模板是关键。。再就是酶，具有自己经验只要引物和模板好，一般都能扩出来。

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26楼2017-01-21 10:01:22
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王艳发

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你还是精提DNA吧

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27楼2017-01-21 14:49:44
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hazenotfog

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
对，感觉先单独把模板跑个pcr看看

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28楼2017-01-21 15:12:18
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seascen2016

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
做普通PCR50微升体系我一般用50-100ng的初始模板量，荧光定量的话较灵敏，20微升体系10-30ng模板即可，所以你这个模板量明显太少。
如果普通扩增，建议你直接加10-20微升模板，引物用量也加倍，好运哦~
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29楼2017-01-21 15:18:47
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