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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 求助！关于蛋白表达量以及产量的测定
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)

[求助] 求助！关于蛋白表达量以及产量的测定 已有1人参与

我想要知道每次发酵一定体积的菌液  能够产生多少我的目的蛋白  现在想要制定一个准确的定量方法

我个人的理解是：
（1）关于目的蛋白表达量：利用SDS-PAGE跑全菌电泳  然后用灰度扫描软件进行条带灰度扫描  可以大致确定目的蛋白占全菌蛋白的百分比
但是存在的问题是：这种方法定量很不准确  并且我至今也没有发现一个好用的灰度扫描软件  软件对于条带的标记会因为电泳效果产生较大误差  不该标记的条带会被标记  该标记的往往找不到等等

（2）关于蛋白的产量：取一定量的菌按照一定的方法进行纯化得到我们的目的蛋白  然后测得蛋白浓度  反推计算出全部发酵液能产多少蛋白

以上是我的理解  但是现在的问题是由于一些原因我没法进行纯化的实验  但我希望知道用什么方法能较准确测定我这一批发酵液产的蛋白量  请各位大神给一个思路  谢谢
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1楼 2017-01-10 08:50:16
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

如果你对你的蛋白性质比较了解，是不是可以做一些前处理之类。表达量很高的话，破菌之后，可以考虑简单的分步盐析方法，得到相对纯度大一点的样品。有些时候，重组表达的样品，在合适的盐析条件下，能除去大部分菌体自身蛋白。然后再通过电泳或者紫外的方法定量，那样可能比你直接电泳通过灰度来定量要准确一些。
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5楼2017-01-13 14:38:06
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yxncas-2012 at 2017-01-13 14:38:06
如果你对你的蛋白性质比较了解，是不是可以做一些前处理之类。表达量很高的话，破菌之后，可以考虑简单的分步盐析方法，得到相对纯度大一点的样品。有些时候，重组表达的样品，在合适的盐析条件下，能除去大部分菌体 ...

前处理的目的是使我的目的蛋白所占的比例更大一点  在灰度分析时减少杂蛋白条带的干扰  我的理解对吗？
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6楼2017-01-13 15:32:30
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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十四_14: 金币+50, ★★★很有帮助 2017-01-13 15:49:23
引用回帖:
6楼: Originally posted by 十四_14 at 2017-01-13 15:32:30
前处理的目的是使我的目的蛋白所占的比例更大一点  在灰度分析时减少杂蛋白条带的干扰  我的理解对吗？...

可以这么理解。要是纯度高一些，可以直接用紫外检测蛋白的浓度，也相差不是很大，还很方便快捷。
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7楼2017-01-13 15:38:07
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yxncas-2012 at 2017-01-13 15:38:07
可以这么理解。要是纯度高一些，可以直接用紫外检测蛋白的浓度，也相差不是很大，还很方便快捷。...

还有一个问题  前处理过程中  我的目的蛋白相应的也会损失一点吧？这个损失率不会影响定量结果么？
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8楼2017-01-13 15:50:31
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