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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 求助western blot，急急急
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beanmilk

金虫 (小有名气)

[求助] 求助western blot，急急急 已有1人参与

一个55kDa的目的蛋白，以GAPDH作为内参，但是样品A曝光的时候内参和目的蛋白都没有，样品B曝光的时候有内参和目的条带，但是内参特别浅。两个样品都是一起做的实验。不知道为什么会这样？这两次是新提取的蛋白，之前做的几次GAPDH的条带很清晰，目的条带不明显。请各位大神指导一下。

电泳条件是30V，约55min跑浓缩胶，70V，约1h30min跑10%的分离胶。

转膜是湿转。100V，GAPDH转40min，目的条带转60min

一抗：GAPDH是1:500   目的条带是1:1000

二抗：GAPDH 羊抗鼠1:10000   目的条带是羊抗兔1:10000
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1楼 2017-01-06 13:53:46
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dayinshu

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能因素很多
1）可能提的蛋白问题，蛋白含量低或是上样量低，或是蛋白降解
2）在用loading buffer配制样品时，可能蛋白样本加样不准确
3）转膜可能没有转好，因为你目标和内参是分别转的
4）可能曝光时间不够
建议再做多几次，每个步骤都要留意。
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2楼2017-01-06 14:07:24
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beanmilk

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dayinshu at 2017-01-06 14:07:24
可能因素很多
1）可能提的蛋白问题，蛋白含量低或是上样量低，或是蛋白降解
2）在用loading buffer配制样品时，可能蛋白样本加样不准确
3）转膜可能没有转好，因为你目标和内参是分别转的
4）可能曝光时间不够
...

另一个同学也是用同样的样品，上样量一样，就是目的条带不同，条带挺好的，我很苦恼
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3楼2017-01-06 16:36:07
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