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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 表达包涵体
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coolale

新虫 (初入文坛)

[求助] 表达包涵体

正在表达一个蛋白，最开始用pet29+BL21，表达有包涵体，然后换用origami宿主，破碎后稍微澄清，离心跑胶看过之后目的蛋白量非常少，条带都很难看清，但是有酶活。然后考虑是不是这个蛋白在TriHCI里溶解度太低了，隧往缓冲液里加了5%左右的甘油，结果菌体是很快破开了，但是过了一会稍微变混了一些，但还是透明的，跑胶看了之后，发现目的蛋白条带依然跟以前一样不明显。然后，今天破碎时加了0.5%的吐温20。。结果破碎液始终是浑浊的。。请问有没有碰到类似情况的？要如何是好？为啥加了去污剂居然还是混的。。。
等电点暂时可能没法测，预测是在5点多，我ph7 7.4 8 都用过，现象都差不多。

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1楼 2017-01-05 17:12:31
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)
不明白楼主想要做什么  是想让你的目的蛋白变成可溶表达？还是说你的目的蛋白形成的包涵体  但是条带 也就是目的蛋白量很少？
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2楼2017-01-06 10:46:36
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coolale

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 十四_14 at 2017-01-06 10:46:36
不明白楼主想要做什么  是想让你的目的蛋白变成可溶表达？还是说你的目的蛋白形成的包涵体  但是条带 也就是目的蛋白量很少？

嗯，两个问题都有。一开始是包涵体，后面换了宿主可以破开了，但是超达量很少

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3楼2017-01-08 16:14:17
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by coolale at 2017-01-08 16:14:17
嗯，两个问题都有。一开始是包涵体，后面换了宿主可以破开了，但是超达量很少
...

关于可溶表达这块  Origami我也用过  感觉这个菌的蛋白表达量不高  并且在后期纯化中也不太好  不管是蛋白的纯度还是活性…你可以考虑多试试几种可溶表达宿主  我用过shuffle T7  表达量还不错
除了更换宿主  楼主也可以试一下优化表达条件  比如说低温诱导表达  或者更换质粒载体

诱导的条件优化一下  诱导时间  诱导剂的量等等  看看能不能提高表达量
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4楼2017-01-09 09:02:57
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coolale

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 十四_14 at 2017-01-09 09:02:57
关于可溶表达这块  Origami我也用过  感觉这个菌的蛋白表达量不高  并且在后期纯化中也不太好  不管是蛋白的纯度还是活性…你可以考虑多试试几种可溶表达宿主  我用过shuffle T7  表达量还不错
除了更换宿主  楼主 ...

嗯，这些都试过了，现在去优化密码子了

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5楼2017-01-12 11:28:34
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