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小木虫论坛-学术科研互动平台» 网络生活区» 有奖问答 » 有奖问答中转子版 » 学术实验 » 【蓝白斑筛选出现问题啊】+【有效期至2008年12月31日】
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swallow2007

木虫 (初入文坛)

[交流] 【蓝白斑筛选出现问题啊】+【有效期至2008年12月31日】

我需要将大约700bp的片段插入pMD19-T载体,后经蓝白斑筛选挑取阳性转化子PCR检测后送去测序.
现在出现的问题是取100微升菌液涂布平板后,16个小时之后才出现菌落,菌落中蓝斑较少,白斑较多且小,挑取单菌落经PCR检测后均为假阳性.
请高手指点!

[ Last edited by zzgyb on 2009-1-17 at 10:49 ]
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1楼 2008-12-11 18:41:54
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
swallow2007(金币+1):谢谢参与
swallow2007(金币+1,VIP+0):可能是这个原因吧
酶连有问题，涂布加抗性
赞一下(2人) 回复此楼
帮助虫友，提升自己
2楼2008-12-12 00:42:21
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pissor

木虫 (正式写手)
★ ★
swallow2007(金币+1):谢谢参与
swallow2007(金币+1,VIP+0):Thanks!
   你最初蓝白斑筛选的那个板子还在吗？还在的话，挑取那个板子上的白斑，不用再涂板了，直接摇菌，然后提质粒，作酶切验证，应该不会有问题。因为白斑一般就是，PCR检测具有假阳性。
     你试试看吧。
赞一下(1人) 回复此楼
游离在生存的边缘上，踯躅在科学的门外，溺死在知识的海洋中，转世在报恩的篱下。
3楼2008-12-12 12:47:02
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shenlanf

铜虫 (小有名气)
★ ★
swallow2007(金币+1):谢谢参与
sanko211(金币+1,VIP+0):感谢热心的虫子^_^斑竹奖励
我以前实验也出过这个问题的
如果白斑比蓝斑小很多，而且多且密的话，可能就不是你想要的目标菌，而是一些卫星菌落或者杂菌。
这样的情况说明你的酶连和转化效率都不高
建议改变下连接体系，另外使用转化效率较高的感受态细胞
希望对你有帮助
赞一下(11人) 回复此楼
4楼2008-12-12 13:50:19
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