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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 新手，定量PCR出现下列问题，完全不懂，求大神帮忙！
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lightdream

新虫 (小有名气)
送红花一朵
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8楼: Originally posted by 卡维斯 at 2017-01-03 20:56:24
一般没有影响，不过最好是把循环数调到40-45之间，这样可以看到平台期的。...

请问你平时的引物终浓度是多少呀。我的是2.5uM

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11楼2017-01-05 01:15:01
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lightdream

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by peitaokong at 2017-01-03 17:39:36
如果是表达丰度很高的基因你可以设置为35循环没有问题，如果是表达丰度不是很高的，建议你下次再做可以把循环数调为40个循环。我们一般也是调为40个循环，实际上曲线能够出来，就可以了，至于最后到底有没有能够扩 ...

请问你平时的引物终浓度是多少呀。我的是2.5uM

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12楼2017-01-05 01:15:51
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peitaokong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by lightdream at 2017-01-05 01:15:51
请问你平时的引物终浓度是多少呀。我的是2.5uM
...

我平时引物都是稀释到5p或者10p的混合引物，20μL定量pcr的体系就加1μL的混合引物。
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13楼2017-01-05 08:27:06
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lightdream

新虫 (小有名气)
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13楼: Originally posted by peitaokong at 2017-01-05 08:27:06
我平时引物都是稀释到5p或者10p的混合引物，20μL定量pcr的体系就加1μL的混合引物。...

我也是稀释了十倍之后的上下游混和引物，但是20ul的体系里我能加到5ul
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14楼2017-01-05 08:35:48
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浮笙若梦

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我们研究的是指数期，扩增曲线正常，有明显指数期就行了，有时候基因丰度低看不到平台期，没有平台期不要紧的
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15楼2017-01-05 09:00:10
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peitaokong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by lightdream at 2017-01-05 08:35:48
我也是稀释了十倍之后的上下游混和引物，但是20ul的体系里我能加到5ul...

如果你是10p的引物，加5μL没有必要的。1μL就足够了。
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16楼2017-01-05 09:43:44
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yjqhades

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
17楼2017-01-05 09:57:56
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lightdream

新虫 (小有名气)
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17楼: Originally posted by yjqhades at 2017-01-05 09:57:56
引物加太多了，cDNA也多。如果引物是工作液（10 uM的话，加0.5就够了）
cDNA  2ul
Primer-F 1ul
Primer-R 1ul
Mix 10 ul
剩下的加水
循环数增加到40

之前的师姐就是这么教的，是不是试剂盒不一样比例就不一样呢？我用的是roche的SYBR-Green。
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18楼2017-01-05 10:20:36
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lightdream

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by yjqhades at 2017-01-05 09:57:56
引物加太多了，cDNA也多。如果引物是工作液（10 uM的话，加0.5就够了）
cDNA  2ul
Primer-F 1ul
Primer-R 1ul
Mix 10 ul
剩下的加水
循环数增加到40

请问你的意思就是cDNA 2ul， 上下游引物2ul ，SYBR-Green 10ul，水6ul，对吗？
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19楼2017-01-05 10:22:15
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lightdream

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 浮笙若梦 at 2017-01-05 09:00:10
我们研究的是指数期，扩增曲线正常，有明显指数期就行了，有时候基因丰度低看不到平台期，没有平台期不要紧的

但是从我这个扩增曲线来看，只露了一点点头，完全不知道是正常还是不正常啊。。。。
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20楼2017-01-05 10:23:20
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