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caiqingchong

木虫 (著名写手)

[交流] 2.7kbp 基因一直无法扩增出来??

最近扩增了一个基因,大小2.7k,GC含量50%左右,用的是宝生物的LA酶,用过2x GC baffer和10X baffer2,退火温度从55度一直降到48度(引物退火温度设计为59度),延长时间用过3m和3.5m,但一直难以扩出带,有也就是很淡的带,大小正确,我再用这个做模板,还是扩不出来,这到底是什么原因呢,酶确认是好的,大家帮忙分析一下,这么长的片段应该不难啊!
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)


lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
为什么大家都很喜欢takara的东西……
他们家的酶很差很差,我用过他们的Taq酶和内切酶,效果都太差劲了
换个酶绝对能出来
takara的我只用DNA marker、化学感受态、loading buffer
其他一概不用……
2楼2008-12-10 15:18:33
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panqiuzhen

可以用长片段tag酶
3楼2008-12-10 20:24:35
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

to 3楼
他用的LA Taq就是long PCR用的
只是Takara的酶就是差劲~~~
2.7一点都不算长
4楼2008-12-10 23:00:31
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)

touch down
帮助虫友,提升自己
5楼2008-12-10 23:03:50
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chuyinghao

铁杆木虫 (职业作家)


lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
在出现目的条带那个温度,调节dNTP mixture的镁离子浓度,镁离子浓度高会影响的!!!
6楼2008-12-10 23:09:16
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
lixiaoyi1981(金币+2,VIP+0):相当有经验,建议有空的时候写一些心得和大家分享。谢谢
用下Promega的GoTaq,做普通PCR绝对够
需要一点保真度,用Invitrogen的Platium高保真Taq
普通克隆是够的了
当然要很高抱枕度的话,非PfuUltra2莫属
7楼2008-12-10 23:56:24
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