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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 2.7kbp 基因一直无法扩增出来？？
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caiqingchong

木虫 (著名写手)

[交流] 2.7kbp 基因一直无法扩增出来？？

最近扩增了一个基因，大小2.7k，GC含量50%左右，用的是宝生物的LA酶，用过2x GC baffer和10X baffer2,退火温度从55度一直降到48度（引物退火温度设计为59度），延长时间用过3m和3.5m，但一直难以扩出带，有也就是很淡的带，大小正确，我再用这个做模板，还是扩不出来，这到底是什么原因呢，酶确认是好的，大家帮忙分析一下，这么长的片段应该不难啊！
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1楼 2008-12-10 14:33:20
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
为什么大家都很喜欢takara的东西……
他们家的酶很差很差，我用过他们的Taq酶和内切酶，效果都太差劲了
换个酶绝对能出来
takara的我只用DNA marker、化学感受态、loading buffer
其他一概不用……
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2楼2008-12-10 15:18:33
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panqiuzhen

可以用长片段tag酶
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3楼2008-12-10 20:24:35
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
to 3楼
他用的LA Taq就是long PCR用的
只是Takara的酶就是差劲~~~
2.7一点都不算长
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4楼2008-12-10 23:00:31
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)
touch down
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帮助虫友，提升自己
5楼2008-12-10 23:03:50
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chuyinghao

铁杆木虫 (职业作家)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
在出现目的条带那个温度，调节dNTP mixture的镁离子浓度，镁离子浓度高会影响的！！！
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6楼2008-12-10 23:09:16
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
lixiaoyi1981(金币+2,VIP+0):相当有经验，建议有空的时候写一些心得和大家分享。谢谢
用下Promega的GoTaq，做普通PCR绝对够
需要一点保真度，用Invitrogen的Platium高保真Taq
普通克隆是够的了
当然要很高抱枕度的话，非PfuUltra2莫属
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7楼2008-12-10 23:56:24
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