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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 酶切验证
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
同意7楼观点，明显ApaI是切出两条带。你现在具体的实验，是不是先扩增，然后使用TA克隆导入载体，然后双酶切，你这种情况要排出序列和载体中均没有ApaI位点，不知道你是怎么做的？再者，你这个图要跑一个没有酶切的质粒作为对照，这样更有利于判断你单酶切的效果。最后还有一点你需要注意，每个酶的工作buffer是不同的，需要查一下说明书，看一下是否在你选用的buffer中两个酶的活性都很好，比如说NEB的酶，cutsmart buffer适合很多种酶，但也有没有活性的。所以方方面面都要考虑到。最后给个建议，转入T载体再酶切其实没必要，在引物上直接加上保护碱基，直接双酶切，直接往表达载体上连吧，省去TA克隆，还能省点时间。

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11楼2016-12-25 21:27:14
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Rdan

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by yujiaping1 at 2016-12-25 21:27:14
同意7楼观点，明显ApaI是切出两条带。你现在具体的实验，是不是先扩增，然后使用TA克隆导入载体，然后双酶切，你这种情况要排出序列和载体中均没有ApaI位点，不知道你是怎么做的？再者，你这个图要跑一个没有酶切的 ...

对，buffer是最佳的。可是如果有2个apaI的话，不是应该有3条带？那就是kpnI没有起到作用？不过检查目的基因和T载体上是否有多个APAI位点，确实需要去检查检查。另外，如果直接省去Ta克隆，选择裸切，会不会在连接表达载体的时效率低，连接不上啊？我的基因长度也还算比较大，都是3400左右的。？？

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12楼2016-12-25 22:13:16
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yunyu818

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
13楼2016-12-26 02:49:26
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
(泳道5是marker.6是ApaI单酶切条带，7是KpnI单酶切条带，8是APAI和KPNI双酶切的条带).
楼主应该放个没酶切过的质粒，（7是KpnI单酶切条带）这个像是酶没切开。楼主可以看看KpnI酶切位点旁边是否有其他酶切位点。目的片段与质粒差了600BP，跑电泳应该是2条带的，你这个完全是一条带呀。
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采菊东篱下，悠然见南山。
14楼2016-12-26 09:58:58
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Rdan

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 781055707 at 2016-12-26 09:58:58
(泳道5是marker.6是ApaI单酶切条带，7是KpnI单酶切条带，8是APAI和KPNI双酶切的条带).
楼主应该放个没酶切过的质粒，（7是KpnI单酶切条带）这个像是酶没切开。楼主可以看看KpnI酶切位点旁边是否有其他酶切位点。目 ...

对对对，就是感觉kpnI没有切开，确实应该放个质粒对比的。谢谢！我再试试……

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15楼2016-12-26 12:25:49
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Rdan

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by yunyu818 at 2016-12-26 02:49:26
ApaI 和KpnI 双酶切的结果应该是三条带，但是之前告诉你ApaI的另一个酶切位点应该 和KpnI靠的很近，这就意味着第三条带可能很小，跑电泳跑出去了。...

哦……明白了。好的，谢谢你！

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16楼2016-12-26 12:26:54
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Rdan

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 781055707 at 2016-12-26 09:58:58
(泳道5是marker.6是ApaI单酶切条带，7是KpnI单酶切条带，8是APAI和KPNI双酶切的条带).
楼主应该放个没酶切过的质粒，（7是KpnI单酶切条带）这个像是酶没切开。楼主可以看看KpnI酶切位点旁边是否有其他酶切位点。目 ...

这是我选择APAI和KPNI的依据，不知道有没有参考价值。还请前辈指教指教
酶切验证


酶切验证-1



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17楼2016-12-26 14:19:30
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
按照你说的，6是ApaI单酶切条带，7是KpnI单酶切条带，8是APAI和KPNI双酶切的条带。那么两个单酶切条带都不一样大，第一个考虑酶切位点不止一个(楼上已经提到过了)，第二一个就是pcr扩增的时候有突变，第三个就是你最好加一个质粒的对照，到底切没切开一看就知道了

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···
18楼2016-12-26 14:30:30
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by Rdan at 2016-12-26 12:26:54
哦……明白了。好的，谢谢你！
...

我感觉跑出去的可能性太低了，从图上看，marker跑的还不到胶的一半

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···
19楼2016-12-26 14:33:15
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Rdan

新虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 小冀- at 2016-12-26 14:30:30
按照你说的，6是ApaI单酶切条带，7是KpnI单酶切条带，8是APAI和KPNI双酶切的条带。那么两个单酶切条带都不一样大，第一个考虑酶切位点不止一个(楼上已经提到过了)，第二一个就是pcr扩增的时候有突变，第三个就是你最 ...

嗯嗯，谢谢您的帮助。我再尝试，加上完整的质粒！

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20楼2016-12-26 15:55:21
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