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那些花儿243

铜虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白跑SDS-PAGE形成二聚体、三聚体、四聚体等等这样的ladder，是什么原因？ 已有1人参与

我实验中遇到了一点现象，请各位大神指点。
我的蛋白与无机纳米颗粒作用后，跑SDS-PAGE，胶上显示蛋白不能完全裂开，而是呈现二聚体、三聚体、四聚体等等这样的ladder状态，如下图1所示（图中最下面一条是单体，约50 kDa）。想试图解释形成ladder的机理是什么，目前猜测，是纳米颗粒促进了蛋白之间形成了某种共价或非共价作用，如果是共价作用有没有什么办法把蛋白序列中具体的作用位点解析出来。

我已经做了一点尝试：
1. 把蛋白用含高浓度DTT的buffer处理，ladder的含量无明显变化，如下图所示。
2. 把SDS-PAGE胶中的二聚体、三聚体分别切下，溶出蛋白，loading buffer处理，再次跑SDS-PAGE，发现，二聚体可以断裂成二聚体和单体，三聚体可以断裂成三聚体、二聚体和单体。溶出蛋白，分别用含（+）或不含（-）DTT的loading buffer处理，发现都有部分多聚体裂开，但+DTT裂开的程度更大，如下图所示。
3. 把蛋白用IAM+DTT处理后（IAM修饰巯基，防止被DTT打开的巯基再次形成二硫键），再用loading buffer处理，再跑SDS-PAGE，仍然呈现ladder状（不过不确定IAM的修饰是否有效，据说IAM的修饰非常容易）。

蛋白跑SDS-PAGE形成二聚体、三聚体、四聚体等等这样的ladder，是什么原因？
FIG4.jpg
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1楼 2016-12-23 15:03:13
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那些花儿243

铜虫 (初入文坛)
这个蛋白形成ladder，完全是纳米颗粒导致的（单独蛋白在相同条件下没有ladder）。

并且纳米颗粒10 nm左右，不会进入SDS-PAGE下层胶，所以从胶中切下的二聚体中只有蛋白。

切下的二聚体，重新跑胶，在不用DTT处理的情况下，有部分裂开，这让人怀疑二聚体之间有非共价键作用（不用DTT的情况下，SDS-PAGE应该不会破坏蛋白中的共价键吧？）；在用DTT处理的情况下，裂开的比例更大了，这让人怀疑二聚体之间有二硫键。

所以怀疑纳米颗粒促进蛋白之间形成了某种强烈的共价或非共价作用。
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2楼2016-12-23 15:05:07
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yunyu818

禁虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
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3楼2016-12-25 01:53:37
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匿名

用户注销 (著名写手)
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4楼2016-12-25 13:03:40
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那些花儿243

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yunyu818 at 2016-12-25 01:53:37
我完全同意你的看法，也很赞赏你分析问题的思路，很清晰。因为我不知道你的蛋白的具体信息，也不知道你的纳米颗粒的最初使用目的，所以只能胡乱和你探讨下。

不知道你的蛋白序列中有多少个Cystine，三级结构上有 ...

你非常专业，给的建议非常好。

首先，纳米颗粒增加了monomer的碰撞几率，这个我之前没有很认真考虑过，非常有可能。
然后，我咨询了做质谱的公司，他们说同源聚体蛋白的解析目前非常困难。
另外，我有先用IAM处理蛋白，理论上蛋白上的所有巯基被覆盖（不能确定IAM的修饰是否有效），再加纳米颗粒，ladder仍然存在。粗略观看，形成寡聚体的程度类似，没有细致比较。

我想最好知道蛋白序列上的具体什么位置发生了共价或非共价作用，才比较有意义。
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5楼2016-12-26 22:37:38
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yunyu818

禁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
那些花儿243: 金币+20, ★★★很有帮助 2017-03-23 16:08:25
本帖内容被屏蔽
6楼2016-12-27 02:43:53
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eric201212

铜虫 (小有名气)
楼主找到解决办法了吗？
目前也碰到了类似的情况
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7楼2022-06-23 22:49:18
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