| 查看: 1229 | 回复: 4 | |||
z妲妲主管区长
|
[交流]
初学者对于蛋白纯化的几点体会 已有3人参与
|
|
近来刚接触蛋白纯化的实验，对于研究本来就不多的我来说，这样的实验算是一头雾水。在不断求知，不断实验，不断看书的过程中，现在有几点体会，求大神们来围观指点。 先说明一下我现在的实验，是一个有活性的酶，孢内酶，等电点4~5左右，所以使用弱碱性的阴离子树脂进行纯化。 对于大体方向的实验步骤，实验书籍中都有介绍，无非是确定树脂的类型，确定洗脱剂以及缓冲溶液的pH。这样再进行洗脱剂浓度的测定。 但是在细节方面，我感觉有更多的疑问，致使像我这样的初学者不能进行实验，更为重要的是在遇到困难时如何取解决问题，这是最为重要的。 好了，现在就开始进行我的体会之旅吧。 1、对于弱碱性阴离子树脂，在使用中需要首先活化，一般就是碱-盐-缓冲液。 这里有就问题出现了，为了把树脂的ph调到规定的ph需要进行大量的缓冲液进行冲洗，一般是利用高浓度的缓冲液调整ph后进行冲洗，我现在使用的是PBS，害怕磷酸根离子结合到柱子上的多，所以我没有这么做，我是将树脂放置瓶中，利用盐酸调ph，这样快，但是步骤繁琐，树脂也有损失。下次想着利用高浓度的pBs试试，毕竟是更简便的方法。 2、上柱 蛋白在室温下容易染菌，尤其是利用细菌产的酶，这里就需要利用低温进行，但是很多公司并没有很多条件，那就放冰块在盆子里，放样品，进行原始性上样。 3.上样量 一般是10%·30%，洗脱规律比较明显，书本上引用的。 4、洗脱 我现在遇到的问题是回收率低，提高洗脱浓度，酶活就低了，就是杂蛋白也洗出来了，这样，我想 利用降低ph进行优化，具体的效果如何看下次的实验了。不过不报希望。因为降低ph，目标蛋白和杂蛋白的结合力都小了，容易洗脱。如果能知道主要的杂蛋白的等电点就好了，但是复杂的细胞，里面的酶太多，不容易找，现有的条件液不知道如何去鉴定。 |
回复此楼» 猜你喜欢
342求调剂
已经有9人回复
-
材料与化工调剂一志愿大连海事085600，349
已经有7人回复
-
一志愿武理材料工程302调剂环化或化工
已经有16人回复
-
311求调剂一志愿合肥工业大学
已经有12人回复
-
环境工程调剂
已经有3人回复
-
288求调剂 一志愿哈工大 材料与化工
已经有22人回复
-
085600，321分求调剂
已经有9人回复
-
282求调剂
已经有11人回复
-
一志愿 南京航空航天大学 ，080500材料科学与工程学硕
已经有11人回复
-
土木304求调剂
已经有3人回复
bush119
超级版主
灌水高手
- 应助: 18 (小学生)
- 金币: 869.2
- 散金: 1267
- 红花: 38
- 沙发: 106
- 帖子: 3594
- 在线: 461小时
- 虫号: 1099220
- 注册: 2010-09-15
- 专业: 微生物生理与生物化学
2楼2016-12-19 16:49:11
bush119
兑换贵宾
灌水高手
- 应助: 18 (小学生)
- 金币: 869.2
- 散金: 1267
- 红花: 38
- 沙发: 106
- 帖子: 3594
- 在线: 461小时
- 虫号: 1099220
- 注册: 2010-09-15
- 专业: 微生物生理与生物化学
3楼2016-12-19 16:49:47
13420180917
主管区长
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
本帖内容被屏蔽 |
4楼2017-12-06 17:13:24
wangyuank
主管区长
|
本帖内容被屏蔽 |
5楼2018-08-11 21:59:08
