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z妲妲

新虫 (小有名气)

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专业: 细胞生物学研究中的新方法

[交流] 初学者对于蛋白纯化的几点体会已有3人参与

近来刚接触蛋白纯化的实验，对于研究本来就不多的我来说，这样的实验算是一头雾水。在不断求知，不断实验，不断看书的过程中，现在有几点体会，求大神们来围观指点。

先说明一下我现在的实验，是一个有活性的酶，孢内酶，等电点4~5左右，所以使用弱碱性的阴离子树脂进行纯化。

对于大体方向的实验步骤，实验书籍中都有介绍，无非是确定树脂的类型，确定洗脱剂以及缓冲溶液的pH。这样再进行洗脱剂浓度的测定。

但是在细节方面，我感觉有更多的疑问，致使像我这样的初学者不能进行实验，更为重要的是在遇到困难时如何取解决问题，这是最为重要的。

好了，现在就开始进行我的体会之旅吧。

1、对于弱碱性阴离子树脂，在使用中需要首先活化，一般就是碱-盐-缓冲液。

这里有就问题出现了，为了把树脂的ph调到规定的ph需要进行大量的缓冲液进行冲洗，一般是利用高浓度的缓冲液调整ph后进行冲洗，我现在使用的是PBS，害怕磷酸根离子结合到柱子上的多，所以我没有这么做，我是将树脂放置瓶中，利用盐酸调ph，这样快，但是步骤繁琐，树脂也有损失。下次想着利用高浓度的pBs试试，毕竟是更简便的方法。

2、上柱蛋白在室温下容易染菌，尤其是利用细菌产的酶，这里就需要利用低温进行，但是很多公司并没有很多条件，那就放冰块在盆子里，放样品，进行原始性上样。

3.上样量一般是10%·30%，洗脱规律比较明显，书本上引用的。

4、洗脱我现在遇到的问题是回收率低，提高洗脱浓度，酶活就低了，就是杂蛋白也洗出来了，这样，我想利用降低ph进行优化，具体的效果如何看下次的实验了。不过不报希望。因为降低ph，目标蛋白和杂蛋白的结合力都小了，容易洗脱。如果能知道主要的杂蛋白的等电点就好了，但是复杂的细胞，里面的酶太多，不容易找，现有的条件液不知道如何去鉴定。

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