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可以吗

银虫 (小有名气)

[交流] T4连接后出现的问题,很奇怪

我将目的基因和表达载体双酶切回收后,用T4连接酶,16度连接过夜,连接体系是20微升的。
再转进JM109感受态,37度培养将近12小时。
结果发现培养皿上(含抗生素)长了一层密密麻麻的菌落,几乎连成一片,其中还有分散的、长得比较大的单克隆。
我觉得是我想要的菌落,就试着尽量挑了些,结果pcr有我的目的条带,也能双酶切到我的条带。
可我就是不明白为什么人会长出那么一层像雾一样的菌?这是怎么回事?请教明白的虫有友。谢谢了


[ Last edited by 可以吗 on 2008-12-7 at 20:23 ]
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hihoney

铁杆木虫 (职业作家)


恭喜你,这说明连接效果太好了。
2楼2008-12-07 20:34:57
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)

这说明转化效率很高
3楼2008-12-07 20:41:36
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figo.339

木虫 (著名写手)

转化效率高的原因,下次你吸取菌液涂布平板时少取些(与上次相比),应该会好些。
4楼2008-12-07 21:19:01
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可以吗

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by figo.339 at 2008-12-7 21:19:
转化效率高的原因,下次你吸取菌液涂布平板时少取些(与上次相比),应该会好些。

那为什么有少部分长得大,而绝大多数是小针点那么大?
5楼2008-12-07 21:54:45
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forget1997

银虫 (小有名气)

问楼主一个问题:
连接反应之后,转化JM109之前,质粒要纯化吗?如果要,用什么纯化?
6楼2008-12-08 13:30:57
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ningluztt

铜虫 (小有名气)

★ ★
lixiaoyi1981(金币+2,VIP+0):这是一种解释,谢谢。很多时候,我们要探寻为什么
个人觉得小菌落是卫星菌落,转化后37度培养时间过长就会导致在你的目的菌落附近长出很多小菌落,就是卫星菌落。卫星菌落就是在培养时间较长的情况下,由于 目的菌落中的转化进去的质粒产生的酶将菌落周围的抗生素降解了,使得在目的菌落周围的本来被抑制的大肠杆菌长出来了导致的。
7楼2008-12-08 17:32:45
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synhily

木虫 (正式写手)

请问楼主是平连还是粘连,连接条件是什么?详细说明一下,大家共同学习噻!
8楼2008-12-08 18:31:00
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lybio

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by forget1997 at 2008-12-8 13:30:
问楼主一个问题:
连接反应之后,转化JM109之前,质粒要纯化吗?如果要,用什么纯化?

连接后可直接转化,不用纯化
9楼2008-12-11 14:41:30
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lybio

金虫 (正式写手)

楼主也才培养12h,这时间还不至于出现卫星菌落吧
是不是氨苄失效呢?
10楼2008-12-11 14:42:41
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