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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 酶切之后连接反应的试验计划大家来帮忙修改修改，谢谢
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luckydog52

木虫 (著名写手)

[交流] 酶切之后连接反应的试验计划大家来帮忙修改修改，谢谢

1 酶切反应：

    100 微升质粒回收产物
    加入 EcoR I  3微升
           Buffer EcoR I
           BamH I 6微升   （酶是 Fermentas 的）

     100 微升PCR回收产物
      加入 EcoR I  3微升
           Buffer EcoR I
           BamH I 6微升   （酶是 Fermentas 的）

温育3小时
   
加入 loading Buffer  琼脂糖电泳 回收

2 连接反应

   1微升 质粒酶切产物
   3微升 PCR酶切产物
   1微升 T4连接酶
   BUFFER
   无菌水 补齐到10微升
16度 过夜

电泳回收
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自信源于一次次成功的积累
1楼 2008-12-06 23:25:15
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-20 22:42
连接产物为何还要电泳回收？直接转化了吧
这么少是不可能回收到的
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2楼2008-12-06 23:50:35
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威风之狼

金虫 (小有名气)
4度过夜连接
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3楼2008-12-07 12:01:22
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威风之狼

金虫 (小有名气)
同楼上连接后直接转化  不要再回收
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4楼2008-12-07 12:02:12
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-20 22:41
16度过夜连接是没有问题的 连完后不用回收 可以直接用于转化
赞一下(6人) 回复此楼
5楼2008-12-07 13:13:21
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luckydog52

木虫 (著名写手)
谢谢大家！
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自信源于一次次成功的积累
6楼2008-12-21 23:13:20
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)
我们双酶切的时候，都是用的共用的buffer，不知道你买的这个公司的酶是不是就用其中的buffer，你也没有说明你的酶切切开没有
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帮助虫友，提升自己
7楼2008-12-22 10:13:16
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-20 22:41
酶切的buffer你要小心点，我不知知道你的说明书上是怎么写的，不过BamH I酶切效率没有EcoR I 的高，选Buffer要尽量满足BamH I
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8楼2008-12-22 17:29:32
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xychern

★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-20 22:41
不需要100ul这么大的酶切体系,控制在20ul足够了

一般37度6小时以上,如果没有星型切割,可以考虑过夜酶切
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9楼2008-12-23 21:01:05
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