| 查看: 2080 | 回复: 6 | |||
[交流]
大鼠肝星状细胞原代培养实验 已有4人参与
|
|
大鼠肝星状细胞原代培养可以：（1）用于细胞保种；（2）用于分子生物学研究；（3）用于基因治疗研究。 实验方法原理 将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。 实验材料 SD大鼠 试剂、试剂盒：戊巴比妥钠、小牛血清、DMEM、酶消化液、D-Hanks' 液、酚红、台盼兰、HBSS、氯化钠、PBS 仪器、耗材：手术刀、手术剪、尼龙网、相差显微镜、荧光显微镜 一、实验材料准备 1. 动物：雄性SD大鼠(体重250-450 g)。 2. 试剂：戊巴比妥钠，小牛血清(或胎牛血清，则更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4.7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚红 0.02 g/L)，HBSS，台盼兰等。 3. 器械：手术器械，200目尼龙网，相差显微镜，荧光显微镜。 二、原代培养方法 1. 大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管，以D-Hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型胶原酶)。 2. 待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型胶原酶)消化15 min，尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃，下同)。 3. 以HBSS重悬沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于离心管中，并分别覆以2-3 ml HBSS，1450 g离心16 min后取界面细胞。 4. 以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105细胞/cm2)，次日换液，以后每2-3天换液一次。 三、传代方法 弃去培液后以D-Hanks'液洗两次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)，充分吹打后以1:2-1:3接种，然后继续培养(5% CO2，37℃)。 四、 结果 接种次日，光镜下可见细胞呈星芒状，胞质内有脂滴，荧光镜下328 nm处见自发荧光。 五、注意事项 1. 进一步鉴别需要做免疫组化：Desmin和α-SMA；后者在细胞激活后才表达。 2. 采用无须原位消化的方案，完全可行，只不过消化时间更难控制！实验采用原代培养的或传代后9代内的细胞(最好5代以内)。 |
回复此楼» 猜你喜欢
0856调剂，是学校就去
已经有9人回复
-
298-一志愿中国农业大学-求调剂
已经有9人回复
-
265求调剂
已经有7人回复
-
求调剂
已经有4人回复
-
学校已经提交到NSFC，还能修改吗？
已经有7人回复
-
材料学硕297已过四六级求调剂推荐
已经有6人回复
-
295复试调剂
已经有7人回复
-
本人考085602 化学工程 专硕
已经有20人回复
-
一志愿中南化学337求调剂
已经有5人回复
-
281求调剂（0805）
已经有23人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
zuiaixuexi
至尊木虫 (文坛精英)
- 应助: 41 (小学生)
- 金币: 27261.7
- 散金: 400
- 红花: 51
- 沙发: 63
- 帖子: 31364
- 在线: 360.5小时
- 虫号: 4350002
- 注册: 2016-01-11
- 性别: GG
- 专业: 会计学
2楼2016-11-30 14:19:58
3楼2016-12-28 16:32:56
4楼2017-10-25 22:01:59
5楼2017-10-25 22:06:40
6楼2017-10-25 22:16:09
7楼2020-10-30 13:23:19
