应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 荧光定量pcr实验步骤
51/1返回列表
查看: 4651  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

z妲妲

新虫 (小有名气)

[交流] 荧光定量pcr实验步骤 已有4人参与

1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）

   1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。

   2）取100mg组织，加入到匀浆器中。

   3）充分研磨直至无可见组织块。

   4）13000g离心10min取上清。

   5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。

   6）4℃下13000g离心8min。

   7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。

   8）-20℃放置15min。

   9）4℃下13000g离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。

   10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。

   11）4℃下13000g离心5min。

   12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。

   13）加入20μl无RNA酶的水溶解RNA。

   14）55℃孵育5min。

2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）

   1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

   2）加入1μl oligo(dT)15。

   3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。

   4）于PCR仪上70℃保温5min，迅速置冰上冷却。

   5）依次加入4μl  5×buffer，2μl  10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。

   6）于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。

3、定量PCR

   1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。

   2× qPCR Mix  12.5μl

   7.5μM基因引物 2.0μl

   反转录产物  2.5μl

   ddH2O   8.0μl

   2）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。

   2×qPCR Mix  12.5μl

   7.5μM内参引物 2.0μl

   反转录产物  2.5μl

   ddH2O   8.0μl

   3）PCR扩增

   预变性    95℃，10min

   循环（40次）      95℃，15s→60℃，60s

   溶解曲线   75℃→95℃，每20s升温1℃

4、结果处理

   ΔΔCT法：

   A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)

   B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)

   K=A-B

   表达倍数=2-K

   注意事项

   1、长度：15—30bp。

   2、G十c含量：应在40%一60%之间。

   3、碱基分布的随机性

   4、引物自身：最好不要含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。

   5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。

   6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。

   7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。

   8、设计RT-PCR的引物时，上下游引物要跨内含子，以消除基因组DNA的干扰。

   9、引物设计好后再NCBI上进行序列比对，检查是否可能有错配产物扩增。

   10、引物设计要注意种属。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

初入实验室 分子操作

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
细胞检测，蛋白检测，Western-blot，ELISA检测，PCR，基因检测，组织学检测，病毒学，微生物，动物实验等专业实验室进行相关领域的技术；联系电话15179183096
1楼 2016-11-30 11:09:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

超杰


发自小木虫Android客户端
2楼2016-12-11 22:03:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sherrytaosha
3楼2017-01-07 09:42:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

崔雪燕cui

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你好，请问如果我测定菌1和菌2的同一个基因的相对表达量，那么计算时候我可不可以利用菌1作为对照组，然后求菌2该基因表达量是菌1的表达倍数呢

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
4楼2017-02-17 21:38:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Angela_Hu

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不是应该有退火的过程么？为啥没看见啊

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
5楼2017-12-01 07:10:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 z妲妲 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 312求调剂 +3 上岸吧ZJY 2026-03-22 5/250 2026-03-25 14:50 by 雾散后相遇lc
[考研] 0854人工智能方向招收调剂 +4 章小鱼567 2026-03-24 4/200 2026-03-25 13:29 by 2177681040
[考研] 299求调剂 +7 shxchem 2026-03-20 9/450 2026-03-25 10:41 by lbsjt
[考研] 303求调剂 +3 蓝山月 2026-03-25 3/150 2026-03-25 10:04 by 雾散后相遇lc
[考研] 上海电力大学材料防护与新材料重点实验室招收调剂研究生（材料、化学、电化学，环境） +4 我爱学电池 2026-03-23 4/200 2026-03-25 00:59 by 1027_324
[考研] 311求调剂 +3 冬十三 2026-03-24 3/150 2026-03-24 21:31 by peike
[考研] 求调剂 +5 林之夕 2026-03-24 5/250 2026-03-24 17:16 by dick_runner
[考研] 070300化学求调剂 +9 苑豆豆 2026-03-20 9/450 2026-03-24 17:15 by licg0208
[考研] 335求调剂 +4 yuyu宇 2026-03-23 5/250 2026-03-23 23:49 by Txy@872106
[考研] 环境学硕288求调剂 +8 皮皮皮123456 2026-03-22 8/400 2026-03-23 23:47 by 热情沙漠
[考研] 一志愿上海交大生物与医药专硕324分，求调剂 +5 jiajunX 2026-03-22 5/250 2026-03-23 18:07 by YMU施老师
[考研] 材料与化工085600，总分304，本科有两篇sci参与，求调剂 +4 幸运的酱酱 2026-03-22 5/250 2026-03-22 20:15 by edmund7
[考研] 求调剂 +5 Zhangbod 2026-03-21 7/350 2026-03-22 13:13 by Zhangbod
[考研] 297求调剂 +3 喜欢还是不甘心 2026-03-20 3/150 2026-03-21 18:33 by 学员8dgXkO
[考研] 317求调剂 +5 申子申申 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:26 by JourneyLucky
[考研] 329求调剂 +9 想上学吖吖 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:01 by luoyongfeng
[考研] 295材料求调剂，一志愿武汉理工085601专硕 +5 Charlieyq 2026-03-19 5/250 2026-03-20 20:35 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +3 @taotao 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:35 by JourneyLucky
[考研] 086500 325 求调剂 +3 领带小熊 2026-03-19 3/150 2026-03-20 18:38 by 尽舜尧1
[考研] 材料考研调剂 +3 xwt。 2026-03-19 3/150 2026-03-19 11:22 by w沐阳w
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭