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gxsulong

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 怎样保证酶切位点不丢失?

我最近在做易错PCR,做完后产物通过胶回收,用BamH 1和Bgl2进行双酶切。但与载体连的时候总是连不上,我怀疑我在做易错PCR的过程中酶切位点丢失导致PCR产物不能酶切。现在查了很久都查不出原因,谁做过这方面的实验,怎么避免在PCR过程中酶切位点不丢失?(我的应为设有保护碱基)谢谢!
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霉菌
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qgaoamtf

至尊木虫 (职业作家)

★ ★
sxdxrhyy(金币+2,VIP+0):谢谢参与! 2-22 08:58
1. 先将PCR产物连接到T载体,再测序;
2. 如酶切位点突变,再用保真度高的聚合酶以含PCR产物的T载体为模板,在新的PCR产物中恢复酶切位点。
2楼2008-12-04 19:56:24
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gxsulong

至尊木虫 (著名写手)

好的,谢谢。我明天试试看
霉菌
3楼2008-12-04 20:05:37
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qgaoamtf

至尊木虫 (职业作家)

补充: 将PCR产物连接到T载体后,先双酶切试试,如能切下回收PCR产物,先不急于测序。不过BamH1和Bgl2是同尾酶,载体自身连接概率很大。PCR产物插入方向可以是双向的。
Good luck!
4楼2008-12-04 21:16:08
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caoqishu

铜虫 (初入文坛)


★ ★
sxdxrhyy(金币+2,VIP+0):谢谢参与! 2-22 08:58
就是啊,BamH1和Bgl2是同尾酶,载体自身连接概率很大。PCR产物插入方向也可以是双向的。如果你的载体是用其中一个酶切的话,要进行去磷酸化。连接要做一个空载体对照,转化涂板后,看对照组的菌长的要是多的话,那么自连的就很多。
如果可以的话,最好不要用同尾酶切。
5楼2009-02-22 01:01:15
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