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所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实验材料 细胞样品 试剂、试剂盒 RNA提取试剂盒、荧光定量PCR、 Mix、TRIZOL、dNTP、氯仿逆转录酶MMLV、异丙醇、Taq酶、DEPC水、ddH2O、TEMgCl2、琼脂糖、溴化乙锭、MOPS、甲醛、乙酸钠、EDTA、EB、溴酚兰 实验步骤 一、 样品RNA的抽提 1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 2. 两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 3. RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 4. RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。 5. RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 二、 RNA质量检测 1. 紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。 （1）浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5 μl，1:100稀释至495 μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg （2）纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定 （1）制胶 1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度 成分 0.4 M MOPS，pH 7.0 0.1 M 乙酸钠 0.01 M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 （2）准备RNA样品 取3 μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。 （3）电泳 上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。 （4）紫外透射光下观察并拍照 28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。 三、样品cDNA合成 1. 反应体系 序号 反应物 剂量 1 逆转录buffer 2 μl 2 上游引物 0.2 μl 3 下游引物 0.2 μl 4 dNTP 0.1 μl 5 逆转录酶MMLV 0.5 μl 6 DEPC水 5 μl 7 RNA模版 2 μl 8 总体积 10 μl 轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。 2. 混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5 μl，37℃水浴60分钟。 3. 取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。 四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR 1. β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3 μl按10倍稀释（加水27 μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。 2. 反应体系如下： 标准品反应体系 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10 μl 2 阳性模板上游引物F 0.5 μl 3 阳性模板下游引物R 0.5 μl 4 dNTP 0.5 μl 5 Taq酶 1 μl 6 阳性模板DNA 5 μl 7 ddH2O 32.5 μl 8 总体积 50 μl 轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。 3. 管家基因反应体系： 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10 μl 2 内参照上游引物F 0.5 μl 3 内参照下游引物R 0.5 μl 4 dNTP 0.5 μl 5 Taq酶 1 μl 6 待测样品cDNA 5 μl 7 ddH2O 32.5 μl 8 总体积 50 μl 轻弹管底将溶液混合， 6000 rpm短暂离心。 3. 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃ 2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。 五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板 1. 针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。 2. 反应体系 序号 反应物 剂量 1 10× PCR缓冲液 2.5 ul 2 MgCl2 溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至总体积为 25 ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72?C延伸5分钟。 （3）PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。 （4）将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。 六、 待测样品的待测基因实时定量PCR 1. 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。 2. 体系配置如下： 序号 反应物 剂量 1 SYBR Green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1 ul 3 下游引物 1 ul 4 dNTP 1 ul 5 Taq聚合酶 2 ul 6 待测样品cDNA 5 ul 7 ddH2O 30 ul 8 总体积 50 ul 轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm短暂离心。 （3）将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃ 2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。 七、 实时定量PCR使用引物列表 引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 八、电泳 各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。 |
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