²é¿´: 4165  |  »Ø¸´: 2
µ±Ç°Ö»ÏÔʾÂú×ãÖ¸¶¨Ìõ¼þµÄ»ØÌû£¬µã»÷ÕâÀï²é¿´±¾»°ÌâµÄËùÓлØÌû

Nigori

Í­³æ (СÓÐÃûÆø)

[½»Á÷] ʵʱӫ¹â¶¨Á¿PCRÒÑÓÐ2È˲ÎÓë

Ëùνʵʱӫ¹â¶¨Á¿PCR¼¼Êõ£¬ÊÇÖ¸ÔÚPCR·´Ó¦ÌåϵÖмÓÈëÓ«¹â»ùÍÅ£¬ÀûÓÃÓ«¹âÐźŻýÀÛʵʱ¼à²âÕû¸öPCR½ø³Ì£¬×îºóͨ¹ý±ê×¼ÇúÏ߶Ôδ֪ģ°å½øÐж¨Á¿·ÖÎöµÄ·½·¨¡£

ʵÑé²ÄÁÏ        ϸ°ûÑùÆ·

ÊÔ¼Á¡¢ÊÔ¼ÁºÐ        RNAÌáÈ¡ÊÔ¼ÁºÐ¡¢Ó«¹â¶¨Á¿PCR¡¢ Mix¡¢TRIZOL¡¢dNTP¡¢ÂÈ·ÂÄæת¼øMMLV¡¢Òì±û´¼¡¢Taqø¡¢DEPCË®¡¢ddH2O¡¢TEMgCl2¡¢ÇíÖ¬ÌÇ¡¢ä廯ÒÒ¶§¡¢MOPS¡¢¼×È©¡¢ÒÒËáÄÆ¡¢EDTA¡¢EB¡¢äå·ÓÀ¼

ʵÑé²½Öè

Ò»¡¢ ÑùÆ·RNAµÄ³éÌá
 
1.  È¡¶³´æÒÑÁѽâµÄϸ°û£¬ÊÒηÅÖÃ5·ÖÖÓʹÆäÍêÈ«Èܽ⡣
 
2.  Á½Ïà·ÖÀë ÿ1 mlµÄTRIZOLÊÔ¼ÁÁѽâµÄÑùÆ·ÖмÓÈë0.2 mlµÄÂȷ£¬¸Ç½ô¹Ü¸Ç¡£ÊÖ¶¯¾çÁÒÕñµ´¹ÜÌå15Ãëºó£¬15µ½30¡æ·õÓý2µ½3·ÖÖÓ¡£4¡æÏÂ12 000 rpmÀëÐÄ15·ÖÖÓ¡£ÀëÐĺó»ìºÏÒºÌ彫·ÖΪϲãµÄºìÉ«·ÓÂÈ·ÂÏ࣬Öмä²ãÒÔ¼°ÎÞÉ«Ë®ÏàÉϲ㡣RNAÈ«²¿±»·ÖÅäÓÚË®ÏàÖС£Ë®ÏàÉϲãµÄÌå»ý´óÔ¼ÊÇÔȽ¬Ê±¼ÓÈëµÄTRIZOLÊÔ¼ÁµÄ60%¡£
 
3.  RNA³Áµí ½«Ë®ÏàÉϲãתÒƵ½Ò»¸É¾»ÎÞRNAøµÄÀëÐĹÜÖС£¼ÓµÈÌå»ýÒì±û´¼»ìºÏÒÔ³ÁµíÆäÖеÄRNA£¬»ìÔȺó15µ½30¡æ·õÓý10·ÖÖÓºó£¬ÓÚ4¡æÏÂ12 000 rpm ÀëÐÄ10·ÖÖÓ¡£´ËʱÀëÐÄÇ°²»¿É¼ûµÄRNA³Áµí½«Ôڹܵײ¿ºÍ²à±ÚÉÏÐγɽº×´³Áµí¿é¡£
 
4.  RNAÇåÏ´ ÒÆÈ¥ÉÏÇåÒº£¬Ã¿1 mlTRIZOLÊÔ¼ÁÁѽâµÄÑùÆ·ÖмÓÈëÖÁÉÙ1 mlµÄ75%ÒÒ´¼£¨75%ÒÒ´¼ÓÃDEPCH2OÅäÖÆ£©£¬ÇåÏ´RNA³Áµí¡£»ìÔȺó£¬4¡æÏÂ7 000 rpmÀëÐÄ5·ÖÖÓ¡£
 
5.  RNA¸ÉÔï СÐÄÎüÈ¥´ó²¿·ÖÒÒ´¼ÈÜÒº£¬Ê¹RNA³ÁµíÔÚÊÒοÕÆøÖиÉÔï5-10·ÖÖÓ¡£
 
6.  ÈܽâRNA³Áµí ÈܽâRNAʱ£¬ÏȼÓÈëÎÞRNAøµÄË®40¦ÌlÓÃǹ·´¸´´µ´ò¼¸´Î£¬Ê¹ÆäÍêÈ«Èܽ⣬»ñµÃµÄRNAÈÜÒº±£´æÓÚ-80¡æ´ýÓá£
 
¶þ¡¢ RNAÖÊÁ¿¼ì²â
 
1.  ×ÏÍâÎüÊÕ·¨²â¶¨
 
ÏÈÓÃÏ¡ÊÍÓõÄTEÈÜÒº½«·Ö¹â¹â¶È¼Æµ÷Á㡣ȻºóÈ¡ÉÙÁ¿RNAÈÜÒºÓÃTEÏ¡ÊÍ£¨1:100£©ºó£¬¶ÁÈ¡ÆäÔÚ·Ö¹â¹â¶È¼Æ260nmºÍ280nm´¦µÄÎüÊÕÖµ£¬²â¶¨RNAÈÜÒº Ũ¶ÈºÍ´¿¶È¡£
 
 £¨1£©Å¨¶È²â¶¨
 
A260϶ÁֵΪ1±íʾ40 ¦Ìg RNA/ml¡£ÑùÆ·RNAŨ¶È(¦Ìg/ml)¼ÆË㹫ʽΪ£ºA260 ¡ÁÏ¡Êͱ¶Êý¡Á 40 ¦Ìg/ml¡£¾ßÌå¼ÆËãÈçÏ£º
 
RNAÈÜÓÚ40 ¦Ìl DEPCË®ÖУ¬È¡5 ¦Ìl£¬1:100Ï¡ÊÍÖÁ495 ¦ÌlµÄTEÖУ¬²âµÃA260 = 0.21
 
RNA Ũ¶È= 0.21 ¡Á100 ¡Á40 ¦Ìg/ml = 840 ¦Ìg/ml »ò 0.84 ¦Ìg/¦Ìl
 
È¡5 ulÓÃÀ´²âÁ¿ÒÔºó£¬Ê£ÓàÑùÆ·RNAΪ35 ¦Ìl£¬Ê£ÓàRNA×ÜÁ¿Îª£º
 
35 ¦Ìl ¡Á 0.84 ¦Ìg/¦Ìl = 29.4 ¦Ìg
 
£¨2£©´¿¶È¼ì²â
 
RNAÈÜÒºµÄA260/A280µÄ±ÈÖµ¼´ÎªRNA´¿¶È£¬±ÈÖµ·¶Î§1.8µ½2.1¡£
 
2.  ±äÐÔÇíÖ¬ÌÇÄý½ºµçÓ¾²â¶¨
 
£¨1£©Öƽº
 
1 gÇíÖ¬ÌÇÈÜÓÚ72 mlË®ÖУ¬ÀäÈ´ÖÁ60¡æ£¬10 mlµÄ10¡Á MOPSµçÓ¾»º³åÒººÍ18 mlµÄ37% ¼×È©ÈÜÒº(12.3 M)¡£

10¡ÁMOPSµçÓ¾»º³åÒº
Ũ¶È  ³É·Ö
0.4 M  MOPS£¬pH 7.0
0.1 M  ÒÒËáÄÆ
0.01 M  EDTA
 
¹àÖÆÄý½º°å£¬Ô¤Áô¼ÓÑù¿×ÖÁÉÙ¿ÉÒÔ¼ÓÈë25 ¦ÌlÈÜÒº¡£½ºÄýºóÈ¡ÏÂÊá×Ó£¬½«Äý½º°å·ÅÈëµçÓ¾²ÛÄÚ£¬¼Ó×ãÁ¿µÄ1¡ÁMOPSµçÓ¾»º³åÒºÖÁ¸²¸Ç½ºÃ漸¸öºÁÃס£
 
£¨2£©×¼±¸RNAÑùÆ·
 
È¡3 ¦ÌgRNA£¬¼Ó3±¶Ìå»ýµÄ¼×È©ÉÏÑùȾҺ£¬¼ÓEBÓÚ¼×È©ÉÏÑùȾҺÖÐÖÁÖÕŨ¶ÈΪ10 ¦Ìg/ml¡£¼ÓÈÈÖÁ70¡æ·õÓý15·ÖÖÓʹÑùÆ·±äÐÔ¡£
 
£¨3£©µçÓ¾
 
ÉÏÑùÇ°Äý½ºÐëÔ¤µçÓ¾5 min£¬Ëæºó½«ÑùÆ·¼ÓÈëÉÏÑù¿×¡£5-6 V/cmµçѹÏÂ2 h£¬µçÓ¾ÖÁäå·ÓÀ¼Ö¸Ê¾¼Á½ø½ºÖÁÉÙ2-3 cm¡£
 
£¨4£©×ÏÍâ͸Éä¹âϹ۲첢ÅÄÕÕ
 
28SºÍ18SºËÌÇÌåRNAµÄ´ø·Ç³£ÁÁ¶øŨ£¨Æä´óС¾ö¶¨ÓÚÓÃÓÚ³éÌáRNAµÄÎïÖÖÀàÐÍ£©£¬ÉÏÃæÒ»Ìõ´øµÄÃܶȴóÔ¼ÊÇÏÂÃæÒ»Ìõ´øµÄ2±¶¡£»¹ÓпÉÄܹ۲쵽һ¸ö¸üСÉÔ΢À©É¢µÄ´ø£¬ËüÓɵͷÖ×ÓÁ¿µÄRNA£¨tRNAºÍ5SºËÌÇÌåRNA£©×é³É¡£ÔÚ18SºÍ28SºËÌÇÌå´øÖ®¼ä¿ÉÒÔ¿´µ½Ò»Æ¬ÃÖÉ¢µÄEBȾɫÎïÖÊ£¬¿ÉÄÜÊÇÓÉmRNAºÍÆäËüÒìÐÍRNA×é³É¡£RNAÖƱ¸¹ý³ÌÖÐÈç¹û³öÏÖDNAÎÛȾ£¬½«»áÔÚ28SºËÌÇÌåRNA´øµÄÉÏÃæ³öÏÖ£¬¼´¸ü¸ß·Ö×ÓÁ¿µÄÃÖɢǨÒÆÎïÖÊ»òÕß´ø£¬RNAµÄ½µ½â±íÏÖΪºËÌÇÌåRNA´øµÄÃÖÉ¢¡£ÓÃÊýÂëÕÕÏà»úÅÄϵçÓ¾½á¹û¡£
 
Èý¡¢ÑùÆ·cDNAºÏ³É
 
1.  ·´Ó¦Ìåϵ
 
ÐòºÅ          ·´Ó¦Îï           ¼ÁÁ¿
1          Äæת¼buffer       2 ¦Ìl
2         ÉÏÓÎÒýÎï              0.2 ¦Ìl
3         ÏÂÓÎÒýÎï              0.2 ¦Ìl
4          dNTP                   0.1 ¦Ìl
5       Äæת¼øMMLV     0.5 ¦Ìl
6         DEPCË®              5 ¦Ìl
7          RNAÄ£°æ            2 ¦Ìl
8           ×ÜÌå»ý               10 ¦Ìl
 
Çᵯ¹Üµ×½«ÈÜÒº»ìºÏ£¬6 000 rpm¶ÌÔÝÀëÐÄ¡£
 
2.  »ìºÏÒºÔÚ¼ÓÈëÄæת¼øMMLV ֮ǰÏÈ70¡æ¸ÉÔ¡3·ÖÖÓ£¬È¡³öºóÁ¢¼´±ùˮԡÖÁ¹ÜÄÚÍâζÈÒ»Ö£¬È»ºó¼ÓÄæת¼ø0.5 ¦Ìl£¬37¡æˮԡ60·ÖÖÓ¡£
 
3.  È¡³öºóÁ¢¼´95¡æ¸ÉÔ¡3·ÖÖÓ£¬µÃµ½Äæת¼ÖÕÈÜÒº¼´ÎªcDNAÈÜÒº£¬±£´æÓÚ-80¡æ´ýÓá£
 
ËÄ¡¢ ÌݶÈÏ¡Ê͵ıê׼Ʒ¼°´ý²âÑùÆ·µÄ¹Ü¼Ò»ùÒò£¨¦Â-actin£©ÊµÊ±¶¨Á¿PCR
 
1.  ¦Â-actinÑôÐÔÄ£°åµÄ±ê×¼ÌݶÈÖƱ¸ ÑôÐÔÄ£°åµÄŨ¶ÈΪ1011£¬·´Ó¦Ç°È¡3 ¦Ìl°´10±¶Ï¡ÊÍ£¨¼ÓË®27 ¦Ìl²¢³ä·Ö»ìÔÈ£©Îª1010£¬ÒÀ´ÎÏ¡ÊÍÖÁ109¡¢108¡¢107¡¢106¡¢105¡¢104£¬ÒÔ±¸Óá£
 
2.  ·´Ó¦ÌåϵÈçÏ£º
 
±ê׼Ʒ·´Ó¦Ìåϵ
 
ÐòºÅ           ·´Ó¦Îï                           ¼ÁÁ¿
1       SYBR Green 1 ȾÁÏ             10 ¦Ìl
2       ÑôÐÔÄ£°åÉÏÓÎÒýÎïF              0.5 ¦Ìl
3      ÑôÐÔÄ£°åÏÂÓÎÒýÎïR              0.5 ¦Ìl
4                 dNTP                            0.5 ¦Ìl
5                 Taqø                           1 ¦Ìl
6           ÑôÐÔÄ£°åDNA                    5 ¦Ìl
7              ddH2O                            32.5 ¦Ìl
8               ×ÜÌå»ý                            50 ¦Ìl
 
Çᵯ¹Üµ×½«ÈÜÒº»ìºÏ£¬6 000 rpm¶ÌÔÝÀëÐÄ¡£
 
3.  ¹Ü¼Ò»ùÒò·´Ó¦Ìåϵ£º
 
ÐòºÅ            ·´Ó¦Îï                                ¼ÁÁ¿
1      SYBR Green 1 ȾÁÏ                   10 ¦Ìl
2      ÄÚ²ÎÕÕÉÏÓÎÒýÎïF                         0.5 ¦Ìl
3     ÄÚ²ÎÕÕÏÂÓÎÒýÎïR                         0.5 ¦Ìl
4               dNTP                                    0.5 ¦Ìl
5               Taqø                                   1 ¦Ìl
6      ´ý²âÑùÆ·cDNA                             5 ¦Ìl
7              ddH2O                                  32.5 ¦Ìl
8             ×ÜÌå»ý                                    50 ¦Ìl
 
Çᵯ¹Üµ×½«ÈÜÒº»ìºÏ£¬ 6000 rpm¶ÌÔÝÀëÐÄ¡£
 
3.  ÖƱ¸ºÃµÄÑôÐÔ±ê׼ƷºÍ¼ì²âÑù±¾Í¬Ê±ÉÏ»ú£¬·´Ó¦Ìõ¼þΪ£º93¡æ¡¡2·ÖÖÓ£¬È»ºó93¡æ 1·ÖÖÓ£¬55¡æ 2·ÖÖÓ£¬¹²40¸öÑ­»·¡£
 
Îå¡¢ ÖƱ¸ÓÃÓÚ»æÖÆÌݶÈÏ¡Êͱê×¼ÇúÏßµÄDNAÄ£°å
 
1.  Õë¶ÔÿһÐèÒª²âÁ¿µÄ»ùÒò£¬Ñ¡Ôñһȷ¶¨±í´ï¸Ã»ùÒòµÄcDNAÄ£°å½øÐÐPCR·´Ó¦¡£
 
2.  ·´Ó¦Ìåϵ
 
ÐòºÅ                     ·´Ó¦Îï                        ¼ÁÁ¿
1                     10¡Á PCR»º³åÒº            2.5 ul
2                           MgCl2 ÈÜÒº              1.5 ul
3                           ÉÏÓÎÒýÎïF                 0.5 ul
4                           ÏÂÓÎÒýÎïR                0.5 ul
5                            dNTP»ìºÏÒº            3 ul
6                            Taq¾ÛºÏø               1 ul
7                             cDNA                       1 ul
8                    ¼ÓË®ÖÁ×ÜÌå»ýΪ               25 ul
 
Çᵯ¹Üµ×½«ÈÜÒº»ìºÏ£¬6000rpm¶ÌÔÝÀëÐÄ¡£
 
35¸öPCRÑ­»·£¨94¡æ1·ÖÖÓ£»55¡æ1·ÖÖÓ£»72¡æ1·ÖÖÓ£©£» 72?CÑÓÉì5·ÖÖÓ¡£
 
£¨3£©PCR²úÎïÓë DNA LadderÔÚ2£¥ÇíÖ¬ÌÇÄý½ºµçÓ¾£¬ä廯ÒÒ¶§È¾É«£¬¼ì²âPCR²úÎïÊÇ·ñΪµ¥Ò»ÌØÒìÐÔÀ©ÔöÌõ´ø¡£
 
£¨4£©½«PCR²úÎï½øÐÐ10±¶ÌݶÈÏ¡ÊÍ: ½«PCR²úÎï½øÐÐ10±¶ÌݶÈÏ¡ÊÍ: É趨PCR²úÎïŨ¶ÈΪ1¡Á1010£¬ÒÀ´ÎÏ¡ÊÍÖÁ109¡¢108¡¢107¡¢106¡¢105¡¢104¼¸¸öŨ¶ÈÌݶȡ£
 
Áù¡¢ ´ý²âÑùÆ·µÄ´ý²â»ùÒòʵʱ¶¨Á¿PCR

1.  ËùÓÐcDNAÑùÆ··Ö±ðÅäÖÃʵʱ¶¨Á¿ PCR·´Ó¦Ìåϵ¡£
 
2.  ÌåϵÅäÖÃÈçÏ£º
 
ÐòºÅ             ·´Ó¦Îï                                ¼ÁÁ¿
1            SYBR Green 1 ȾÁÏ               10 ul
2                ÉÏÓÎÒýÎï                               1 ul
3                ÏÂÓÎÒýÎï                               1 ul
4                  dNTP                                   1 ul
5              Taq¾ÛºÏø                               2 ul
6             ´ý²âÑùÆ·cDNA                        5 ul
7                   ddH2O                              30 ul
8                   ×ÜÌå»ý                               50 ul
 
Çᵯ¹Üµ×½«ÈÜÒº»ìºÏ£¬6 000 rpm¶ÌÔÝÀëÐÄ¡£
 
£¨3£©½«ÅäÖƺõÄPCR·´Ó¦ÈÜÒºÖÃÓÚRealtime PCRÒÇÉϽøÐÐPCRÀ©Ôö·´Ó¦¡£·´Ó¦Ìõ¼þΪ£º93¡æ 2·ÖÖÓÔ¤±äÐÔ£¬È»ºó°´93¡æ 1·ÖÖÓ£¬55¡æ1·ÖÖÓ£¬72¡æ1·ÖÖÓ£¬¹²40×ö¸öÑ­»·£¬×îºó72¡æ7·ÖÖÓÑÓÉì¡£
 
Æß¡¢ ʵʱ¶¨Á¿PCRʹÓÃÒýÎïÁбí
 
ÒýÎïÉè¼ÆÈí¼þ£ºPrimer Premier 5.0£¬²¢×ñÑ­ÒÔÏÂÔ­Ôò£ºÒýÎïÓëÄ£°åµÄÐòÁнôÃÜ»¥²¹£»ÒýÎïÓëÒýÎïÖ®¼ä±ÜÃâÐγÉÎȶ¨µÄ¶þ¾ÛÌå»ò·¢¼Ð½á¹¹£»ÒýÎï²»ÔÚÄ£°åµÄ·ÇÄ¿µÄλµãÒý·¢DNA ¾ÛºÏ·´Ó¦(¼´´íÅä)¡£
 
°Ë¡¢µçÓ¾
 
¸÷ÑùÆ·µÄÄ¿µÄ»ùÒòºÍ¹Ü¼Ò»ùÒò·Ö±ð½øÐÐRealtime PCR·´Ó¦¡£PCR²úÎïÓë DNA LadderÔÚ2£¥ÇíÖ¬ÌÇÄý½ºµçÓ¾£¬GoldViewȾɫ£¬¼ì²âPCR²úÎïÊÇ·ñΪµ¥Ò»ÌØÒìÐÔÀ©ÔöÌõ´ø¡£
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ÒÑÔÄ   »Ø¸´´ËÂ¥   ¹Ø×¢TA ¸øTA·¢ÏûÏ¢ ËÍTAºì»¨ TAµÄ»ØÌû
3Â¥2024-04-22 16:42:57
ÒÑÔÄ   »Ø¸´´ËÂ¥   ¹Ø×¢TA ¸øTA·¢ÏûÏ¢ ËÍTAºì»¨ TAµÄ»ØÌû
Ïà¹Ø°æ¿éÌøת ÎÒÒª¶©ÔÄÂ¥Ö÷ Nigori µÄÖ÷Ìâ¸üÐÂ
×î¾ßÈËÆøÈÈÌûÍƼö [²é¿´È«²¿] ×÷Õß »Ø/¿´ ×îºó·¢±í
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[ÂÛÎÄͶ¸å] µÚһƪÂÛÎÄͶ¸å½ø³Ì¼Ç¼ +4 É÷¶ÀµÄС»¨¾í 2024-06-20 9/450 2024-06-20 20:37 by É÷¶ÀµÄС»¨¾í
ÐÅÏ¢Ìáʾ
ÇëÌî´¦ÀíÒâ¼û