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condy

新虫 (小有名气)

[求助] 用EB染PAGE胶检测EMSA是否成功,遇到困惑。 已有1人参与

考虑到标记DNA后做EMSA的方法很麻烦,就先用没标记的DNA做EMSA,跑完非变性胶后直接EB染色。结果见图 DNA marker右边一次是100ng的自由DNA,100ngDNA+15uM蛋白,100ngDNA+30uM蛋白,100ngDNA+60uM蛋白,100ngDNA+80uM蛋白. 结果很像是发生了阻滞,但为什么阻滞的蛋白条带是斜的?而且发生阻滞后一点自由DNA也看不到? 蛋白质能被EB染色吗?
   望高手解答,不胜感激!

用EB染PAGE胶检测EMSA是否成功,遇到困惑。
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13504927475

新虫 (初入文坛)

你好,我也在做这样的实验,用没标记的DNA做EMSA,不知道可不可告诉一下你具体的过程呢,
3楼2019-07-08 21:11:17
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domopal

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

首先,蛋白质不能被EB染色(见EB染色原理)。其次,阻滞后一点自由DNA也看不到可能是你的蛋白质过量,把探针结合完全了。你可以减低蛋白浓度,多做几个梯度。一般蛋白质2uM就能明显看到延迟带。
2楼2017-11-27 17:06:32
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