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dcb005

金虫 (著名写手)

[交流] 酶切不能获得目的基因条带

转化后,长出的菌落做菌落PCR,可以扩出和目的基因一样大小的条带,挑取可以扩出目的带的菌落(在做菌落PCR时已经做相应的划线培养),提取质粒后,双酶切也没有切出750bp大小的条带。我的载体是PBI 121
       请教,这是什么原因?如何解决?
       谢谢您的帮助!

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-2 at 12:10 ]
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★穷则独善其身,达则兼济天下★
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qwky2010

金虫 (著名写手)

目的片段中有可能是含有酶切位点,或许就是双酶切体系有问题
天道酬勤
2楼2008-12-02 21:32:45
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dcb005

金虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by qwky2010 at 2008-12-2 21:32:
目的片段中有可能是含有酶切位点,或许就是双酶切体系有问题

设计引物时已经考虑到了酶切位点,序列中不可能含酶切位点,体系是切T载体的体系,T载体切开了,应该没什么问题
但双酶切就是切不开
★穷则独善其身,达则兼济天下★
3楼2008-12-02 21:43:20
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)

有没有加保护碱基
帮助虫友,提升自己
4楼2008-12-05 04:48:50
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yuhuimeiye

木虫 (著名写手)

考虑一下酶切体系,建议过夜切,如果只是为了鉴定,不行就测序吧
5楼2008-12-05 08:17:33
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bbyu007

木虫 (正式写手)

试试分步酶切,或者调整酶切体系,实在切不出来,直接送去测序吧
我是笨笨鱼~~~
6楼2008-12-05 09:20:05
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

也有可能是上样量的问题,看不清楚
7楼2008-12-05 09:20:33
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cynjau

金虫 (小有名气)

酶切5-6小时后,用2%的胶电泳看看!
还有就是你用PCR鉴定是不准确的,我也遇到这种情况的。
因为引物可能不特异的,你也许会奇怪为什么非特异性片段为什么和目的片段大小一样?这我也不知道为什么!
你把空载体也PCR一下,很可能也能获得那个片段!
所以我现在都不做PCR检测,直接酶切检测的,由于你的片段相对于载体较小,用浓度较大的胶,点上10微升的酶切产物检测!祝好!
8楼2008-12-07 16:48:16
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figo.339

木虫 (著名写手)

做单双酶切,同时双酶切要分布酶切,同时要考虑是不是酶的问题。
9楼2008-12-07 21:30:59
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