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大分子蛋白western条带总出现在泳道顶端 已有1人参与
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? 最近的wb目的条带总在泳道顶端出现，我的目的条带是190k，胶浓度试10%，page120V2h，转膜500mA2h，转膜液20%甲醇。结果如图。上面的标记为蛋白样品煮过之后保存条件。 已经得出：室温（rt）下存放的蛋白样品降解，所以拖尾，但是不懂为什么是从泳道顶端向下拖尾的？不应该是从我的目的蛋白190k向下拖尾吗？ 上网查原因得知可能是“鬼带”： “ “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶?端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀， 主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子 量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同 的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 ?????处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补 充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。 ” 但是，昨天新煮的样品，煮后又给每管（20ul）加了0.3ul巯基乙醇，放入-20度过夜后今天在冰上化了再用的。这样的样品仍然在泳道顶出来了条带，虽然目的190k处也有条带，但是很不好看。 是因为煮过的样品冻了再化之后有了沉淀吗？还是像“鬼带”里说的产生了很大的蛋白？ 希望能有人帮帮忙找下原因哈。  发自小木虫Android客户端 |
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