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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 大分子蛋白western条带总出现在泳道顶端
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39052ty

银虫 (初入文坛)

[求助] 大分子蛋白western条带总出现在泳道顶端 已有1人参与

?

最近的wb目的条带总在泳道顶端出现，我的目的条带是190k，胶浓度试10%，page120V2h，转膜500mA2h，转膜液20%甲醇。结果如图。上面的标记为蛋白样品煮过之后保存条件。

已经得出：室温（rt）下存放的蛋白样品降解，所以拖尾，但是不懂为什么是从泳道顶端向下拖尾的？不应该是从我的目的蛋白190k向下拖尾吗？

上网查原因得知可能是“鬼带”：

“

“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶?端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀， 主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子 量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同 的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

?????处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补 充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

”

但是，昨天新煮的样品，煮后又给每管（20ul）加了0.3ul巯基乙醇，放入-20度过夜后今天在冰上化了再用的。这样的样品仍然在泳道顶出来了条带，虽然目的190k处也有条带，但是很不好看。

是因为煮过的样品冻了再化之后有了沉淀吗？还是像“鬼带”里说的产生了很大的蛋白？

希望能有人帮帮忙找下原因哈。

大分子蛋白western条带总出现在泳道顶端


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1楼 2016-10-13 16:26:57
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wuhu0612331

铜虫 (正式写手)
上样前超声并离心

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2楼2016-10-14 07:14:36
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般来说应该就是样品溶解性不好，使用DTT（而不是BME）或者用盐浓度较高的缓冲液来配置蛋白溶液有时候能解决问题
当然也有可能性这些是ubiquitin修饰过的蛋白，一般poly-ubiquitinated的蛋白就长这个样子，从你的描述来看这可能性不大。
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
3楼2016-10-14 07:59:40
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39052ty

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2016-10-14 07:59:40
一般来说应该就是样品溶解性不好，使用DTT（而不是BME）或者用盐浓度较高的缓冲液来配置蛋白溶液有时候能解决问题
当然也有可能性这些是ubiquitin修饰过的蛋白，一般poly-ubiquitinated的蛋白就长这个样子，从你的 ...

DTT和2ME哪里不一样呢？

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4楼2016-10-14 12:04:56
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
引用回帖:
4楼: Originally posted by 39052ty at 2016-10-13 23:04:56
DTT和2ME哪里不一样呢？
...

大部分情况下没啥区别，DTT还原性稍微强点。
有过一次经历，加了BME但还是有个很浅的二聚体条带，加了DTT条带就没了。
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
5楼2016-10-14 22:51:21
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39052ty

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2016-10-14 22:51:21
大部分情况下没啥区别，DTT还原性稍微强点。
有过一次经历，加了BME但还是有个很浅的二聚体条带，加了DTT条带就没了。...

这样啊，谢谢！

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6楼2016-10-14 23:49:03
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