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wuqianqian

新虫 (初入文坛)

[求助] pet28a重组质粒双酶切,pmd19t重组质粒双酶切 已有1人参与

10ul酶切体系:28a 质粒1是maker 2xhol单酶切 3xhol和Ndel双酶切,4目的基因 5是Ndel单酶切
pmd19t质粒 6maker 7xhol 8xhol和ndel 9目的基因 10Ndel
单酶切条带很奇怪
250bp的maker
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pet28a重组质粒双酶切,pmd19t重组质粒双酶切


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mould

金虫 (小有名气)

钻石

1你没有对连有目的基因的pet28a的条带进行跑胶,2你单酶切的不彻底,3酶切体系不宜过大。

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人生没有如果,却有很多但是!
2楼2016-10-07 20:31:20
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wuqianqian

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by mould at 2016-10-07 20:31:20
1你没有对连有目的基因的pet28a的条带进行跑胶,2你单酶切的不彻底,3酶切体系不宜过大。

酶跑胶,我只测了浓度73.4ng/ul。酶切体系10ul,质粒加了8ul, takara酶0.5ul。

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3楼2016-10-07 22:38:33
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mould

金虫 (小有名气)

钻石

引用回帖:
3楼: Originally posted by wuqianqian at 2016-10-07 22:38:33
酶跑胶,我只测了浓度73.4ng/ul。酶切体系10ul,质粒加了8ul, takara酶0.5ul。
...

质粒加的太多了,检测用3ul左右就够了,或者酶切的时间短,单酶切后多条带是酶切不彻底,而且你pmd19双酶切后两条目的条带应该是杂带吧?建议你做个pcr检测下,同时做好阴性对照。

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人生没有如果,却有很多但是!
4楼2016-10-08 10:16:05
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wanglei512

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1、28a这张图没有问题是对的,只不过质粒浓度太高,酶切不充分,只需测序鉴定一下就行,最终还是要看测序结果
2、19这张图结果有问题是错的,双酶切后的目的条带应该和PCR的结果大小一样
3、一般我们都不用pmd-19t而是用pmd-19t simple,后者没有酶切位点,干扰较小
4、有的时候如果连接的片段太小,双酶切后目的条带浓度会很低,在图上看不到,所以还是要以测序为准
5、选双酶切位点要选择酶切效率高的,便宜的、常用的酶
5楼2016-10-08 18:11:51
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wuqianqian

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by mould at 2016-10-08 10:16:05
质粒加的太多了,检测用3ul左右就够了,或者酶切的时间短,单酶切后多条带是酶切不彻底,而且你pmd19双酶切后两条目的条带应该是杂带吧?建议你做个pcr检测下,同时做好阴性对照。
...

谢谢

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6楼2016-10-10 19:24:29
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wuqianqian

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by wanglei512 at 2016-10-08 18:11:51
1、28a这张图没有问题是对的,只不过质粒浓度太高,酶切不充分,只需测序鉴定一下就行,最终还是要看测序结果
2、19这张图结果有问题是错的,双酶切后的目的条带应该和PCR的结果大小一样
3、一般我们都不用pmd-19 ...

非常感谢,经过测序发现我的目的条带插入是正确的,我的pmd19t提的浓度是368ng/ul,与28a加的体系是一样的,可能是质粒加入过多,重新调整一下质粒量,谢谢你的建议。

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7楼2016-10-10 19:28:15
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