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sunmaocai

铜虫 (小有名气)

[交流] 关于酶切酶连

请问pcdna3.1经HindIII和KpnI酶切后是平端还是粘段啊?我做酶连怎么连不起来啊?

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-6 at 20:39 ]
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

都是黏端
首先确认,是否酶切完全
再次才是确认连接反应有无问题
我用NEB的内切酶,1ug pcDNA加1U酶反应1小时,电泳验证酶切完全
用TOYOBO的ligation high Ver 2,反应30min连接完全
2楼2008-11-24 12:57:06
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
sunmaocai(金币+2,VIP+0): g
确认酶切是否完全,可以分别单酶切,然后跑电泳,看看质粒是否完全线性化了

确认是否连接上,首先在保证感受态的转化效率(转空质粒)以及酶切完全的前提下,看看重组子有没有长出菌来,没长就是连接不上。
3楼2008-11-24 12:59:06
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

回复你的站内信

提质粒之后一般会有几条带,分别是不同构型的,但是用酶切线性化之后,就只剩一条带
因此只要同时跑酶切前后的质粒一看就知道是否酶切完全了
4楼2008-11-24 13:47:06
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

继续回你站内信……其实发贴就好了,无需站内信

你刚刚抽提出来的空质粒不会都是线性化的吧,不同构型的质粒在琼脂糖胶中,即使分子量一样,位置也会不一样,总之,酶切之后就是线性化的,只要你的空质粒不是已经线性化的就能看出差别
5楼2008-11-24 14:08:05
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