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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于酶切酶连
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sunmaocai

铜虫 (小有名气)

[交流] 关于酶切酶连

请问pcdna3.1经HindIII和KpnI酶切后是平端还是粘段啊？我做酶连怎么连不起来啊？

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-6 at 20:39 ]
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1楼 2008-11-24 11:44:35
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
都是黏端
首先确认，是否酶切完全
再次才是确认连接反应有无问题
我用NEB的内切酶，1ug pcDNA加1U酶反应1小时，电泳验证酶切完全
用TOYOBO的ligation high Ver 2，反应30min连接完全
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2楼2008-11-24 12:57:06
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
sunmaocai(金币+2,VIP+0): g
确认酶切是否完全，可以分别单酶切，然后跑电泳，看看质粒是否完全线性化了

确认是否连接上，首先在保证感受态的转化效率（转空质粒）以及酶切完全的前提下，看看重组子有没有长出菌来，没长就是连接不上。
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3楼2008-11-24 12:59:06
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
回复你的站内信

提质粒之后一般会有几条带，分别是不同构型的，但是用酶切线性化之后，就只剩一条带
因此只要同时跑酶切前后的质粒一看就知道是否酶切完全了
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4楼2008-11-24 13:47:06
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
继续回你站内信……其实发贴就好了，无需站内信

你刚刚抽提出来的空质粒不会都是线性化的吧，不同构型的质粒在琼脂糖胶中，即使分子量一样，位置也会不一样，总之，酶切之后就是线性化的，只要你的空质粒不是已经线性化的就能看出差别
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5楼2008-11-24 14:08:05
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