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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 蛋白跑PAGE，发现上清、沉淀都有目的带，怎么解
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prthefu

木虫 (著名写手)

[交流] 蛋白跑PAGE，发现上清、沉淀都有目的带，怎么解 已有6人参与

某蛋白，原核表达，带His标签。  氨基酸理论预测分子量约32kDa，加上his标签的大小，应该对条带位置影响不大吧。
1、跑PAGE后，图1，发现重组菌的上清、沉淀在对应大小出都出现了目的条带（35下面），现在也不确定到底是哪个条带，是沉淀处较浅的那个单一带还是上清中稍微有些上翻的带。
2、分析蛋白疏水性的时候，图2，得出的值是MIN: -3.289, MAX: 2.656 ，这应该说明该蛋白偏亲水性大于疏水性，而且，由图知，两边亲水，中间疏水，但是整体来说，蛋白是亲水还是疏水呢？确定了它是亲水还是疏水，是不是就知道上清or沉淀的带是目的条带。
3、关于纯化，如果过镍柱，洗脱得到的管中有很多盐，并不是纯化的蛋白，过柱后还这么做呢。

蛋白跑PAGE，发现上清、沉淀都有目的带，怎么解
图2.png


蛋白跑PAGE，发现上清、沉淀都有目的带，怎么解-1
图1.png
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1楼 2016-09-20 10:56:53
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hc-material

专家顾问 (职业作家)
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没明白你要描述的啥问题。
1.破碎后上清沉淀都有目标很正常，确定那个是目标蛋白条带可以用没诱导的菌跑电泳对照，会很明显。
破碎后上清沉淀都有目标，有各种可能，比如菌没破碎彻底，有部分是包涵体表达，还有破碎的沉淀没洗等，都有可能是电泳结果呈现出上清沉淀都有蛋白的现象。
过柱后盐描述的啥问题没太清楚，过镍柱后，洗脱里面有杂质也正常，可以拉梯度洗脱，镍柱后或前也可以在加其他的层析，比如离子或疏水的。
洗脱液中盐的去处可以超滤，过葡聚糖凝胶G25层析分离都可以。祝顺利。
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2楼2016-09-20 14:28:48
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prthefu

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by milamiya at 2016-09-21 17:37:34
超声半小时都有可能把蛋白超变性了哦，不过这个对你的结果影响应该不大吧，可以确定是部分包涵体表达了。调整一下发酵条件看看是否可以全部可溶表达。...

如果超声破碎后进行上清、沉淀的分离，沉淀用PBS洗，需要涡旋、离心，洗，还是加入PBS再稍微离一下就可以呢？
还有一个疑问，沉淀用PBS进行溶解，但发现加入后，涡旋，然后再放置一段时间后，总是会有沉淀，不溶，那再用沉淀跑胶的时候，是需要把所有的都悬起来还是直接去上面的呢？
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6楼2016-09-23 15:19:28
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prthefu

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hc-material at 2016-09-20 14:28:48
没明白你要描述的啥问题。
1.破碎后上清沉淀都有目标很正常，确定那个是目标蛋白条带可以用没诱导的菌跑电泳对照，会很明显。
破碎后上清沉淀都有目标，有各种可能，比如菌没破碎彻底，有部分是包涵体表达，还有破 ...

我想问，根据我提供的蛋白疏水性分析，能确定该蛋白是亲水的吗？
另外，在破碎时，超声近半个小时，应该够彻底了吧，所以，沉淀还有带，那是包涵体吗？
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3楼2016-09-20 14:55:20
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milamiya

禁虫 (小有名气)
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4楼2016-09-21 17:37:34
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muzi1527

新虫 (初入文坛)
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你跑蛋白的目的是什么？如果有His标签的话，可以做个western blot。 但是看你的SDS gel， 你指的两个条带应该都是你的目的蛋白，上清和沉淀中都有是很正常的。而且无论沉淀中有没有蛋白，只要上清中有就可以了，你可以纯化进行下一步的分析了，不用纠结这个问题。
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5楼2016-09-22 21:50:15
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prthefu

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by muzi1527 at 2016-09-22 21:50:15
你跑蛋白的目的是什么？如果有His标签的话，可以做个western blot。 但是看你的SDS gel， 你指的两个条带应该都是你的目的蛋白，上清和沉淀中都有是很正常的。而且无论沉淀中有没有蛋白，只要上清中有就可以了，你可 ...

跑PAGE就是想检测一下蛋白表达情况，带His标签，原本想根据预测的分子量就可以找到目标条带，但是做了几次，发现对应理论分子量处无条带，后来想通过His标签做WB来定位条带，可是做了好多次，都没有成功，显色失败。
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7楼2016-09-23 15:22:11
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milamiya

禁虫 (小有名气)
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8楼2016-09-23 15:31:48
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bright8

铁杆木虫 (著名写手)
很正常了，大部分蛋白用原核表达系统，都是包涵体居多，上清很少了。

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9楼2016-09-23 23:26:31
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prthefu

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by bright8 at 2016-09-23 23:26:31
很正常了，大部分蛋白用原核表达系统，都是包涵体居多，上清很少了。

如果是包含体，大概流程是怎样的呢

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10楼2016-09-24 00:55:32
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