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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 大提质粒时如何提高质粒浓度？
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dehong1573

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-22 22:22:16
和质粒拷贝数有关系，确定你的质粒是不是低拷贝的~够用即可，没必要纠结
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科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
11楼2016-09-21 08:49:48
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中士

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-22 22:21:17
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量。溶液Eluent应在65℃水浴预热，在吸附和洗脱时可以适当延长时间。最后洗脱时可加无水乙醇。
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12楼2016-09-21 09:40:09
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匿名

用户注销 (著名写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-22 22:22:37
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13楼2016-09-22 22:16:47
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特洛克

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

质粒提取，不但困扰了好些新手，而且不少老手提取质粒也不稳定。
影响质粒产量的因素很多，现列举部分，望同道中人完善。

1、质粒本身：高拷贝还是低拷贝，影响特别大。低拷贝的特定质粒可以考虑加氯霉素提高拷贝数（建议先了解氯霉素提高质粒拷贝数的原理，应该不是所有的都有效，可能起到相反效果）。
2. 宿主菌：常用的DH5α等，有利于得到高产量的质粒。另外一些菌种效果可能差很多（同一实验室用相同菌种，若别人得率高，应该可以排除这个原因）。
3. 摇菌时间：这个影响非常大！有一些实验者在这方面做得很不好。建议摇菌12-16小时，时间过短，单个菌体中的质粒拷贝数会低很多！时间过长，当心细菌可能死亡，导致基因组污染等问题。特殊菌种、特殊摇菌温度，时间需另行把握。
4. 摇菌用容器大小：这个影响也是比较大的。摇150ml的菌液，应该用500ml以上的摇菌瓶，效果比250ml或以下的要好。基本原则是摇菌容器的体积是菌液体积的4倍或以上。
5. 菌种来源：新转化的菌种比冻存菌液要好。
6. 培养基：应该用高品质新配置的培养基。
7. 菌液用量：恰当最好，宁少勿多。必须确保充分裂解，否则产量和纯度会显著降低。
8. 质粒提取试剂盒的因素：现在市场上质粒提取试剂盒很多，鱼龙混杂。好些号称高产、高纯度无内毒素大提，实际产量和纯度堪忧。OD260判断浓度、OD260/OD280和OD260/OD230比值判断纯度，很多时候并不客观。好些情况下，杂质含量高，OD260、280、230差不多按比例升高，比值好并不代表纯度就一定好、建议进一步琼脂糖胶电泳。（同一实验同一试剂盒，可排除这方面因素）。
9. 其它因素：待大家补充。
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14楼2016-09-27 17:46:58
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特洛克

新虫 (初入文坛)
另外，质粒大小对产量影响也很大，过大的质粒，产量一般会有不同程度的降低。
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15楼2016-09-27 18:58:55
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lishuaiguang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 010308Jing at 2016-09-18 11:55:55
其实这个跟质粒还是有关系的，你保留点之前的菌液直接扩大会比重新挑克隆好很多

我想用之前转化得到的单克隆，先活化培养再扩大，不知道行不行
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16楼2016-09-27 19:53:41
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Gengli0909

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 熊猫爱吃竹子 at 2016-09-16 16:50:46
用thermo的试剂盒从150ml菌液中提质粒，最后用nano测只有200多ng/ml，别人一般都能提到900ng/ml左右，请问一下有什么需要注意的地方吗，在操作过程中？谢谢

多次上柱收集

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17楼2016-10-20 23:24:33
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wilwis

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by pf790352975 at 2016-09-22 22:16:47
你的质粒浓度单位搞错了，应该是200多ng/ul    假如你浓度测定没问题的话 ，应该是提取的问题，不知道你是高拷贝质粒还是低拷贝质粒，浓度应该至少在1ug/ul

至少在1ug/ul。。。。  请问，你用的哪种试剂盒，最近也一直在提高质粒浓度，只有七八百ug的样子
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18楼2017-11-28 20:19:06
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