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新虫 (小有名气)

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[求助] 大提质粒时如何提高质粒浓度？已有7人参与

用thermo的试剂盒从150ml菌液中提质粒，最后用nano测只有200多ng/ml，别人一般都能提到900ng/ml左右，请问一下有什么需要注意的地方吗，在操作过程中？谢谢

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1楼2016-09-16 16:50:46

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匿名

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13楼2016-09-22 22:16:47

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特洛克

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

质粒提取，不但困扰了好些新手，而且不少老手提取质粒也不稳定。
影响质粒产量的因素很多，现列举部分，望同道中人完善。

1、质粒本身：高拷贝还是低拷贝，影响特别大。低拷贝的特定质粒可以考虑加氯霉素提高拷贝数（建议先了解氯霉素提高质粒拷贝数的原理，应该不是所有的都有效，可能起到相反效果）。
2. 宿主菌：常用的DH5α等，有利于得到高产量的质粒。另外一些菌种效果可能差很多（同一实验室用相同菌种，若别人得率高，应该可以排除这个原因）。
3. 摇菌时间：这个影响非常大！有一些实验者在这方面做得很不好。建议摇菌12-16小时，时间过短，单个菌体中的质粒拷贝数会低很多！时间过长，当心细菌可能死亡，导致基因组污染等问题。特殊菌种、特殊摇菌温度，时间需另行把握。
4. 摇菌用容器大小：这个影响也是比较大的。摇150ml的菌液，应该用500ml以上的摇菌瓶，效果比250ml或以下的要好。基本原则是摇菌容器的体积是菌液体积的4倍或以上。
5. 菌种来源：新转化的菌种比冻存菌液要好。
6. 培养基：应该用高品质新配置的培养基。
7. 菌液用量：恰当最好，宁少勿多。必须确保充分裂解，否则产量和纯度会显著降低。
8. 质粒提取试剂盒的因素：现在市场上质粒提取试剂盒很多，鱼龙混杂。好些号称高产、高纯度无内毒素大提，实际产量和纯度堪忧。OD260判断浓度、OD260/OD280和OD260/OD230比值判断纯度，很多时候并不客观。好些情况下，杂质含量高，OD260、280、230差不多按比例升高，比值好并不代表纯度就一定好、建议进一步琼脂糖胶电泳。（同一实验同一试剂盒，可排除这方面因素）。
9. 其它因素：待大家补充。

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14楼2016-09-27 17:46:58

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